โครงการการพัฒนาการผลิตวัคซีน Formalin killed cell เพื่อต้านเชื้อแบคทีเรีย Vibrio vulnificus ในปลากะพงขาวและปลากะรังในเชิงพาณิชย์

Abstract

งานวิจัยศึกษาการพัฒนาการผลิตวัคซีน Formalin killed cell เพื่อต้านเชื้อแบคทีเรีย Vibrio vulnificus ในปลากะพงขาวและปลากะรังในเชิงพาณิชย์ เพื่อให้ได้สายพันธุ์ที่มีความรุนแรง (virulence strain) ในการก่อโรคไปใช้เป็นวัคซีน ต้องสำรวจจำแนกชนิดและรวบรวมสายพันธุ์แบคทีเรีย Vibrio vulnificus จากปลากะพงขาวและปลากะรังที่เลี้ยงในภูมิภาคต่าง ๆ ของประเทศไทย การศึกษามีระยะเวลา 2 ปี โดยในปีแรกที่รายงานครั้งนี้ ได้มีเชื้อ Vibrio vulnificus VVB (Burapha) ที่ก่อโรคในปลากะพงขาว ของประเทศไทยเมื่อปี พ.ศ. 2547 ถูกจาแนกทางจุลชีววิทยาและเทคนิคทางแอนติบอดีจำเพาะในการจะระบุเป็นสายพันธุ์รุนแรง (virulence strain) เนื่องจากต้องยืนยันการมี virulence gene จึงได้ศึกษาทางเทคนิคชีวโมเลกุลพีซีอาร์ ด้วยการใช้ 5 virulence gene ได้แก่ vcg-C, vvhA, CPS1, vvhA1 และ16s rRNA แต่ CPS1 gene ให้ผลพีซีอาร์ที่ยังไม่ชัดเจน เพื่อต้องการหา unique specific marker ของแบคทีเรียสายพันธุ์ก่อโรครุนแรงนี้ จึงมีการนำเชื้อแบคทีเรียที่แยกได้จากตับและตับอ่อนกุ้ง น้ำเลี้ยงกุ้ง และหอยนางรม มาร่วมทดสอบไพรเมอร์ทั้ง 5 ยีนนี้ ผลยืนยันชัดเจนด้วย specific primer 3 ชนิด ได้แก่ vcg-C, vvhA และ vvhA1 ทำให้สามารถระบุ unique specific marker คือยีน vvhA1 ที่ควบคุมความรุนแรงของแบคทีเรีย ต่อมาเมื่อใช้ไพรเมอร์ V. vulnificus hemolysin (vvhA1) ขนาด DNA fragment ที่ 813 bp ในการจำแนกเชื้อจากปลากะพงขาวและปลากะรัง ที่สำรวจจากการเลี้ยงในภูมิภาคต่าง ๆ 10 จังหวัดชายฝั่ง ของประเทศไทย พบว่า จานวนทั้งหมด 2610 ไอโซเลท จากการเขี่ยเชื้อให้โคโลนีเขียวบนอาหารวุ้นจำเพาะ TCBS สามารถพบเชื้อก่อโรค V. vulnificus ในปลากะพงขาวที่ป่วยเท่านั้น จากการเลี้ยงในกระชัง 1 ฟาร์ม จังหวัดจันทบุรี มี 4 ไอโซเลท ซึ่งยืนยันผลบวกตรงกันทั้ง เทคนิคชีวโมเลกุลพีซีอาร์ ร่วมกับเทคนิคทางแอนติบอดีจาเพาะ และ พบเชื้อก่อโรค V. vulnificus ในปลากะพงขาวที่ป่วย ที่เลี้ยงในบ่อปูน 1 ฟาร์ม จังหวัดฉะเชิงเทรา 2 ไอโซเลท ด้วยเทคนิคทางแอนติบอดีจาเพาะเท่านั้น และเมื่อตรวจโดยตรงจากเนื้อเยื่อตับและไตปลากะพงขาว จำนวน 107 ตัวอย่าง และปลากะรัง จำนวน 105 ตัวอย่าง ด้วยเทคนิคชีวโมเลกุลพีซีอาร์ สามารถพบเชื้อก่อโรค V. vulnificus ในตับปลากะพงขาวป่วย ที่เลี้ยงในบ่อปูน 1 ตัวอย่างจากฟาร์ม จังหวัดฉะเชิงเทรา ทั้งนี้ในการสำรวจปลากะรัง ในภาคใต้ ไม่พบเชื้อ V. vulnificus ทั้งเทคนิคชีวโมเลกุลพีซีอาร์ และเทคนิคทางแอนติบอดีจาเพาะ ดังนั้นในการเลือกไอโซเลทแบคทีเรียเพื่อพัฒนาวัคซีนในปีที่สอง ได้ทดสอบความรุนแรงในการก่อโรคต่อปลากะพงขาว ผลทดสอบ LD50 พบว่า เชื้อ V. vulnificus VVB (Burapha) มีความรุนแรงมากที่สุด ทำให้ปลากะพงขาวตายภายในเวลา 24 ชั่วโมง ณ ระดับความเข้มข้น 5.4 x 106 CFU/g fish body weight เมื่อเปรียบเทียบกับไอโซเลท จากจังหวัดจันทบุรี ฉะเชิงเทรา และ สตูล (unknown specie) ผลวิจัยในปีที่หนึ่งควรมีการศึกษาต่อไปเนื่องจาก unique specific marker มียีน hemolysin vvhA1 ที่ควบคุมความรุนแรงของแบคทีเรียนี้ ยังไม่สามารถระบุ biotype เพื่อก่อให้เกิดประโยชน์ต่อระบาดวิทยาในมนุษย์ที่สัมพันธ์กับสิ่งแวดล้อม