การผลิตปริมาณสูงและการตรึงเอนไซม์อะลิฟาติกอะมิเดสสำหรับประยุกต์ใช้ในกระบวนการสลายอะคริลาไมด์และอุตสาหกรรมการผลิตกรดอะคริลิก

Abstract

การใช้สารพิษอะคริลาไมด์ที่มีแนวโน้มเป็นสารก่อมะเร็งในคนอย่างกว้างขวางส่งผลให้พบการปนเปื้อนในสิ่งแวดล้อม แต่ในความเป็นพิษของอะคริลาไมด์ยังมีจุลินทรีย์บางชนิดสามารถใช้พลังงานจากอะคริลาไมด์ในการเจริญได้ โดยเกิดการสลายอะคริลาไมด์เป็นแอมโมเนียและกรดอะคริลิก จากการทำงานของเอนไซม์อะมิเดส (EC 3.5.1.4.) ด้วยปฏิกิริยาดีอะมิเนชั่น ในโครงงานวิจัยนี้ได้มุ่งเป้าไปที่การใช้เทคนิคพีซีอาร์หาลำดับนิวคลีโอไทด์ของชิ้นยีนอะลิฟาติกอะมิดิสใน Enterobacter aerogenes ซึ่งเป็นแบคทีเรียสลายอะคริลาไมด์ชนิดใหม่ที่คัดแยกได้จากน้ำทิ้งชุมชนใกล้บริเวณนิคมอุตสาหกรรมในจังหวัดชลบุรี และมีศักยภาพในการสลายอะคริลาไมด์สูงที่สุดในจำนวนแบคทีเรียสลายอะคริลาไมด์ที่มีในห้องปฏิบัติ 5 สายพันธุ์ การทดลองเริ่มต้นจากการใช้ดีเจนเนเรซีไพรเมอร์ที่ออกแบบมาจากลำดับกรดอะมิโนบริเวณอนุรักษ์ของยีนอะมิโดไฮโดรเลสในแบคทีเรียสกุล Enterobacter spp. เพิ่มปริมาณและโคลนยีนอะมิเดสช่วงปลายอะมิโนและปลายคาร์บอกซี ที่ประกอบด้วยนิวคลีโอไทดื จำนวน 297 และ 354 คู่เบสตามลำดับ เข้าสู่พลาสมิด pUC118 และทรานส์ฟอร์มเข้า Escherichia coli DH5a นำลำดับนิวคลีโอไทด์ที่หาได้มาออกแบบไพรเมอร์ชุดใหม่เพิ่มเพิ่มปริมาณชิ้นยีนอะลิฟาติกอะมิเดสในช่วงกลางและช่วงปลาย 3' ด้วยเทคนิคพีซีอาร์ย้อนกลับแบบจำเพาะ โคลนผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ที่ได้เข้าสู่พลาสมิด pTG19-T และหาลำดับนิวคลีโอไทด์ทั้งหมด ผลการทดลองที่ได้พบลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนอะลิฟาติกอะมิเดสของ E. aerogenes ขนาด 726 คู่เบส ที่สามารถคาดเดาเป็นกรดอะมิโนจำนวน 241 ตัว และมีความคล้ายคลึงมากกว่าร้อยละ 80 กับยีนของเอนไซม์ในกลุ่มไนไตร์เลส/ไซยาไนด์ ไฮโดรเลสและอะมิเดสของ enterobacteriaceae ที่มีในฐานข้อมูลโลก และลำดับกรดอะมิโนที่คาดเดาจากลำดับนิวคลีโอไทด์ที่หาได้พบความเหมือนมากว่าร้อยละ 88 กับเอนไซม์อะมิเดส เมื่อวิเคราะห์ข้อมุลลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ได้พบกรดอะมิโนแอสปาเทตตำแหน่งที่ 191 และเซรีนตำแหน่งที่ 196 เกี่ยวข้องกับบริเวณแอคทีฟของเอนไซม์ ขณะที่กลูตาเมตตำแหน่งที่ 27 ไลซีนตำแหน่งที่ 92 และ ซีสเทอีนตำแหน่งที่ 126 เป็นกรดอะมิโน ที่เกี่ยวข้องกับการเร่งปฏิกิริยาของเอนไซม์ เมื่อทำการเพิ่มปริมาณชึ้นยีนที่กำหนดการสร้างเอนไซม์อะมิเดสจาก E. aerogenes และโคลนเข้าสู่ดีเอ็นเอพาหะเอื้อการแสดงออก pColdl พบว่าริคอมบิแนนท์อะมิเดสที่โคลนได้มีการแสดงออกเป็นโปรตีนขนาด 28 กิโลดาลตัน ในเซลล์ให้อาศัย Escherichia coli DH5 แต่มีการแสดงออกที่มากเกินไปจนจับกันเป้นก้อนตกตะกอนภายในเซลล์ในรูปของอินคลูชั่นบอดี้ โดยความเข้มข้นของ IPTG การเติมกลูโคส แลคโตส และกลีเซอรอล และการแสดงออกที่อุณหภูมิต่ำไม่สามารถลดการแสดงออกของริคอมบิแนนท์อะมิเดสในรุปของอินคลูชั่นบอดี้ในเซลล์ได้ทั้งหมด ขณะที่การแสดงออกของริคอมบิแนนท์อะมิเดส ในรูปของโปรตีนที่ขับออกนอกเซลล์ของ Bacillus subtillis มีปริมาณที่ต่ำเกินไปจนไม่สามารถทำบริสุทธิ์และตรึงรูปเอนไซม์ต่อไปได้