โครงการการพัฒนาการผลิตวัคซีน Formalin killed cell เพื่อต้านเชื้อแบคทีเรีย Vibrio vulnificus ในปลากะพงขาวและปลากะรังในเชิงพาณิชย์

ปภาศิริ บาร์เนท; มลฤดี สนธิ

dc.contributor.author	ปภาศิริ บาร์เนท
dc.contributor.author	มลฤดี สนธิ
dc.contributor.other	มหาวิทยาลัยบูรพา. คณะวิทยาศาสตร์
dc.date.accessioned	2021-05-12T01:46:02Z
dc.date.available	2021-05-12T01:46:02Z
dc.date.issued	2561
dc.identifier.uri	http://dspace.lib.buu.ac.th/xmlui/handle/1234567890/4070
dc.description	งานวิจัยนี้ได้รับทุนสนับสนุนการวิจัยจากงบประมาณเงินรายได้จากเงินอุดหนุนรัฐบาล (งบประมาณแผ่นดิน) ประจำปีงบประมาณ พ.ศ. 2560	th_TH
dc.description.abstract	งานวิจัยศึกษาการพัฒนาการผลิตวัคซีน Formalin killed cell เพื่อต้านเชื้อแบคทีเรีย Vibrio vulnificus ในปลากะพงขาวและปลากะรังในเชิงพาณิชย์ เพื่อให้ได้สายพันธุ์ที่มีความรุนแรง (virulence strain) ในการก่อโรคไปใช้เป็นวัคซีน ต้องสำรวจจำแนกชนิดและรวบรวมสายพันธุ์แบคทีเรีย Vibrio vulnificus จากปลากะพงขาวและปลากะรังที่เลี้ยงในภูมิภาคต่าง ๆ ของประเทศไทย การศึกษามีระยะเวลา 2 ปี โดยในปีแรกที่รายงานครั้งนี้ ได้มีเชื้อ Vibrio vulnificus VVB (Burapha) ที่ก่อโรคในปลากะพงขาว ของประเทศไทยเมื่อปี พ.ศ. 2547 ถูกจาแนกทางจุลชีววิทยาและเทคนิคทางแอนติบอดีจำเพาะในการจะระบุเป็นสายพันธุ์รุนแรง (virulence strain) เนื่องจากต้องยืนยันการมี virulence gene จึงได้ศึกษาทางเทคนิคชีวโมเลกุลพีซีอาร์ ด้วยการใช้ 5 virulence gene ได้แก่ vcg-C, vvhA, CPS1, vvhA1 และ16s rRNA แต่ CPS1 gene ให้ผลพีซีอาร์ที่ยังไม่ชัดเจน เพื่อต้องการหา unique specific marker ของแบคทีเรียสายพันธุ์ก่อโรครุนแรงนี้ จึงมีการนำเชื้อแบคทีเรียที่แยกได้จากตับและตับอ่อนกุ้ง น้ำเลี้ยงกุ้ง และหอยนางรม มาร่วมทดสอบไพรเมอร์ทั้ง 5 ยีนนี้ ผลยืนยันชัดเจนด้วย specific primer 3 ชนิด ได้แก่ vcg-C, vvhA และ vvhA1 ทำให้สามารถระบุ unique specific marker คือยีน vvhA1 ที่ควบคุมความรุนแรงของแบคทีเรีย ต่อมาเมื่อใช้ไพรเมอร์ V. vulnificus hemolysin (vvhA1) ขนาด DNA fragment ที่ 813 bp ในการจำแนกเชื้อจากปลากะพงขาวและปลากะรัง ที่สำรวจจากการเลี้ยงในภูมิภาคต่าง ๆ 10 จังหวัดชายฝั่ง ของประเทศไทย พบว่า จานวนทั้งหมด 2610 ไอโซเลท จากการเขี่ยเชื้อให้โคโลนีเขียวบนอาหารวุ้นจำเพาะ TCBS สามารถพบเชื้อก่อโรค V. vulnificus ในปลากะพงขาวที่ป่วยเท่านั้น จากการเลี้ยงในกระชัง 1 ฟาร์ม จังหวัดจันทบุรี มี 4 ไอโซเลท ซึ่งยืนยันผลบวกตรงกันทั้ง เทคนิคชีวโมเลกุลพีซีอาร์ ร่วมกับเทคนิคทางแอนติบอดีจาเพาะ และ พบเชื้อก่อโรค V. vulnificus ในปลากะพงขาวที่ป่วย ที่เลี้ยงในบ่อปูน 1 ฟาร์ม จังหวัดฉะเชิงเทรา 2 ไอโซเลท ด้วยเทคนิคทางแอนติบอดีจาเพาะเท่านั้น และเมื่อตรวจโดยตรงจากเนื้อเยื่อตับและไตปลากะพงขาว จำนวน 107 ตัวอย่าง และปลากะรัง จำนวน 105 ตัวอย่าง ด้วยเทคนิคชีวโมเลกุลพีซีอาร์ สามารถพบเชื้อก่อโรค V. vulnificus ในตับปลากะพงขาวป่วย ที่เลี้ยงในบ่อปูน 1 ตัวอย่างจากฟาร์ม จังหวัดฉะเชิงเทรา ทั้งนี้ในการสำรวจปลากะรัง ในภาคใต้ ไม่พบเชื้อ V. vulnificus ทั้งเทคนิคชีวโมเลกุลพีซีอาร์ และเทคนิคทางแอนติบอดีจาเพาะ ดังนั้นในการเลือกไอโซเลทแบคทีเรียเพื่อพัฒนาวัคซีนในปีที่สอง ได้ทดสอบความรุนแรงในการก่อโรคต่อปลากะพงขาว ผลทดสอบ LD50 พบว่า เชื้อ V. vulnificus VVB (Burapha) มีความรุนแรงมากที่สุด ทำให้ปลากะพงขาวตายภายในเวลา 24 ชั่วโมง ณ ระดับความเข้มข้น 5.4 x 106 CFU/g fish body weight เมื่อเปรียบเทียบกับไอโซเลท จากจังหวัดจันทบุรี ฉะเชิงเทรา และ สตูล (unknown specie) ผลวิจัยในปีที่หนึ่งควรมีการศึกษาต่อไปเนื่องจาก unique specific marker มียีน hemolysin vvhA1 ที่ควบคุมความรุนแรงของแบคทีเรียนี้ ยังไม่สามารถระบุ biotype เพื่อก่อให้เกิดประโยชน์ต่อระบาดวิทยาในมนุษย์ที่สัมพันธ์กับสิ่งแวดล้อม	th_TH
dc.description.sponsorship	สำนักงานคณะกรรมการวิจัยแห่งชาติ	th_TH
dc.language.iso	th	th_TH
dc.publisher	คณะวิทยาศาสตร์ มหาวิทยาลัยบูรพา	th_TH
dc.subject	ปลากะพงขาว - - การเลี้ยง	th_TH
dc.subject	ปลากะรัง - - การเลี้ยง	th_TH
dc.subject	ปลา -- การฉีดวัคซีน	th_TH
dc.subject	สาขาเกษตรศาสตร์และชีววิทยา	th_TH
dc.title	โครงการการพัฒนาการผลิตวัคซีน Formalin killed cell เพื่อต้านเชื้อแบคทีเรีย Vibrio vulnificus ในปลากะพงขาวและปลากะรังในเชิงพาณิชย์	th_TH
dc.title.alternative	Development of Formalin-killed cells vaccine against Vibrio vulnificus in Asian seabass (Lates calcarifer) and Grouper (Epinephelus spp.) for commercial purpose	en
dc.type	Research	th_TH
dc.author.email	praparsi@buu.ac.th	th_TH
dc.author.email	molruede@buu.ac.th	th_TH
dc.year	2561	th_TH
dc.description.abstractalternative	The virulent strain of Vibrio vulnificus in farmed Asian Seabass (Lates calcarifer) and Grouper (Epinephelus spp.) poses a challenge to Thai aquaculture. In order to develop a formalin-killed cell vaccine to prevent infection by Vibrio vulnificus, identification of the bacteria species and virulence must be confirmed. One strain of Vibrio vulnificus VVB (Burapha) that has caused Asian Seabass mortality in Thailand since 2004 was identified using microbiological traits and specific antibody technique. The first year of this two-year study was used to investigate the existence of virulence genes in Vibrio vulnificus VVB (Burapha). A PCR technique was applied to five virulence genes, including vcg-C, vvhA, CPS1, vvhA1 and 16s rRNA. However, the results for the CPS gene were unclear. Therefore, to find a unique specific marker for this disease, bacteria were isolated from the liver and pancreas of shrimp, water from shrimp farms, and from oysters. These bacteria were tested with primers of the aforementioned five genes. The results showed that three specific primer sets (vcg-C, vvhA and vvh1) can be used to identify the unique specific marker vvhA1, which controls the virulence of Vibrio vulnificus VVB (Burapha). Subsequently, an 813-bp DNA fragment of the V. vulnificus hemolysis gene (whA1) was detected in bacteria from Asian Seabass and Grouper collected from ten coastal provinces across Thailand. From 2,610 isolates appearing as green colonies on TCBS agar, V. vulnificus was found in only four isolates from Asian Seabass showing disease symptoms, cultured in cages in Chantaburi Province, confirmed by both PCR and specific antibody techniques. Meanwhile, direct tissue detection by PCR method was performed to identify the bacteria from liver and kidney tissue samples from a total of 107 Asian Seabass and 105 Grouper. Results showed V. vulnificus in the livers of sick Asian Seabass cultured in concrete ponds in Chachoengsao Province. Surprisingly, the bacteria colony and tissue samples of Grouper in this survey showed no presence of V. vulnificus. For the purpose of vaccine development in the second year of the study, the most virulent strain was selected for vaccine trials. The experimental injection of four bacterial strains for Asian Seabass infection was conducted. Results of LD50 challenge tests showed Vibrio vulnificus VVB (Burapha) to be the most virulent strain, since it can cause mortality in Asian Seabass within 24 hours at a concentration level 5.4 x 106 CFU/g fish body weight, in comparison to strains from Chantaburi, Chachoengsao, and Satun provinces (unknown species). The results from the first year of this study will be further investigated, since the hemolysin vvhA1 gene can control the same virulence in humans. Finding a genetic marker and its biotype would therefore be beneficial to epidemiological studies related to the environment.	th_TH