Abstract:
งานวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์ในการพัฒนาวิธีการที่อาศัยพื้นฐานของปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสเพื่อตรวจสอบแบคทีเรีย Vibrio parahaemolyticus และ Vibrio vuinificus จากหอยนางรม โดยในปฏิกิริยาสามารถตรวจสอบแบคทีเรียทั้งสองชนิดได้พร้อมกันยีนเป้าหมายที่นำมาใช้ในการตรวจสอบ Vibrio parahaemolyticus ได้แก่ tl (thermolabile hemolysin gene) และ tdh (thermostable direct hemolysin gene) ส่วนการตรวจสอบ Vibrio vuinificus ใช้ยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้าง hemolysin / cytolysin หรือ vvh เป็นยีนเป้าหมาย ไพร์เมอร์ที่ใช้ในการศึกฦษษมีความจำเพาะต่อแบคทีเรียทั้งสองชนิดดังกล่าวเท่านั้น สภาวะที่เหมาะสำหรับการดำเนินปฏิกิริยา PCR แบบมัลติเพล็กซ์ ใช้แมกนีเซียมคลอไรด์ความเข้มข้น 3.0มิลิโมลาร์ และอถณหภูมิสำหรับการลงเกาะของไพร์เมอร์บนดีเอ็นเอแม่แบบคือ 63 องศาเซลเซียส จาการศึกษาวิธีที่เหมาะสมสำหรับการเตรียมดีเอ็นเอแม่แบบจากเชื้อที่ปนเปื้อนอยู่ในหอยนางวรม พบว่า การใช้ SDS –Proteinase K lysis solution ร่วมกับการตกตระกอนดีเอ็นเอด้วยไอโดพรพานอล ให้ผลการดำเนินปฏิกิริยาค่อนข้างดี ความไวงของเทมคนิคในการตรวจ V. parahaemolyticus และ V. Vuinificus โดยตรงจากตัวอย่างหอยนางรมคือ 100 CFU ต่อกรัม และเมื่อเพิ่มขั้นตอนการเพิ่มปริมาณเชื้อในหอยนางรมก่อนการทำ PCR พบว่าเทคนิคนี้มีความไวของการตรวจสอบสูงได้สูงขึ้น (1 CFU ต่อกรัม) เทคนิคที่พัฒนาขึ้นนี้ ได้ผ่านการทดสอบความใช้ได้จริงโดยเปรียบเทียบกับวิธีตรวจสอบมาตรฐาน ซึ่งมีค่าความแม่นยำ ความจำเพาะและความไวของการตรวจสอบ 96-100เปอร์เซนต์ จึงสามารถนำเทคนิคที่พัฒนาขึ้นนี้ไปใช้ในการตรวจสอบ V. parahaemolyticus และ V. Vuinificus แทนวิธีดั้งเดิมได้ ซึ่งสามารถทำได้สะดวกและรวดเร็วกว่า ซึ่งมีประโยชน์ในการลดปัญหาการเจ็บป่วยหรือการตายที่มีสาเหตุมาจากแบคทีเรียทั้งสองชนิด
