การเก็บรักษาน้ำเชื้อปลาตะเพียนขาวและปลาดุกอุยแบบแช่เย็นและแบบแช่แข็งเพื่อการผสมเทียม

Abstract

การเก็บรักษาน้ำเชื้อปลาตะเพียนขาว (Puntius gonionotus) และปลาดุกอุย (Clarias macrocephalus) แบบแช่เย็นโดยการนำเอาน้ำเชื้อสดมาเจือจางในสารละลายบัฟเฟอร์ภายใน rissue culture flask ในอัตราส่วน 1: 1 โดยปริมาตร และเก็บแช่เย็นที่อุณหภูมิ 0-4 องศาเซียลเซียส ปรากฏว่าสารละลาย Calcium-free Hank’s balanced salt solution (Ca-F HBSS) มีความเหมาะสมในการแช่เย็นน้ำเชื้อ ปลาตะเพียนขาวมากที่สุดเมื่อเปรียบเทียบกับการใช้ Hank’s balanced salt solution (HBSS), Cortland solution, Extender 7 และ Extender 13 เนื่องจากสามารถยืดระยะเวลาการเก็บรักษาน้ำเชื้อแช่เย็นได้นานกว่าสารละลายบัฟเฟอร์สูตรอื่นๆ โดยการเจือจางน้ำเชื้อปลาตะเพียนขาวใน Ca-F HBSS สามารถเจือจางได้มากที่สุดเพียง 1 : 2 โดยปริมาตรเท่านั้น เนื่องจากการใช้อัตราเจือจางที่สูงขึ้นทำให้ระยะเวลาที่สามารถเก็บรักษาน้ำเชื้อได้สั้นลง การแช่น้ำเชื้อปลาดุกอุยพบว่าสารละลาย HBSS ให้ผลการเก็บรักษาน้ำเชื้อได้ดีที่สุดเมื่อเปรียบเทียบกับการใช้ Extender 7, Extender 13 และ Cortland solution โดยไม่พบความแตกต่างของอัตราส่วนการเจือจางน้ำเชื้อใน HBSS ในอัตราส่วนตั้งแต่ 1: 1, 1 : 2 และ 1 : 4 การเก็บรักษาน้ำเชื้อปลาตะเพียนขาว และปลาดุกอุยแบบแช่แข็งได้แบ่งการทดลองออกเป็น 2 ตอน คือ ตอนที่ 1 ทดสอบความเป็นพิษของสารละลายไครโอโพรเทคแทนท์ และตอนที่ 2 การแช่แข็งน้ำเชื้อด้วยเครื่องมือ controlled-rate programmable freezer การทดสอบความเป็นพิษของสารไครโอโพรเทคแทนท์ต่อน้ำเชื้อปลาตะเพียนขาวทำโดยน้ำเชื้อปลาตะเพียนขาวมาเจือจางในสารไครโอโพรเทคแทนท์ชนิดต่างๆ ได้แก่ Dimethylsulfoxide (DMSO), acetamide, methanol, formamide, sucrose, propylene glycol, glycerol, ethanol และ ethylene glycol โดยที่แต่ละชนิดใช้ความเข้มข้นสุดท้าย 4 ระดับ(5%, 10%, 15% และ 20%) ทำการทดสอบใน tissue culture flask ที่อุณหภูมิ 25 °C พบว่า methanol, sucrose และ DMSO มีความเป็นพิษต่อน้ำเชื้อปลาตะเพียนขาวในระดับที่ต่ำ ในขณะที่การทดสอบความเป็นพิษของสารไครโอโพรเทคแทนท์ต่อน้ำเชื้อปลาดุกอุยพบว่า propylene glycol, glycerol และ formamide มีความเป็นพิษต่ำ เมื่อเปรียบเทียบกับ acetamide และ ethylene glycol การแช่แข็งน้ำเชื้อปลาตะเพียนขาวในน้ำยาสูตร Ca-F HBSS โดยใช้ DMSO ที่ความเข้มข้น 5%, 10%, 15% และ 20% เป็นสารไครโอโพรเทคแทนท์โดยใช้อัตราการลดอุณหภูมิ 3 ระดับ ได้แก่ การลดอุณหภูมิอย่างรวดเร็ว (10°C/นาที), ระดับการลดอุณหภูมิอย่างปานกลาง (5°C/นาที) และระดับการลดอุณหภูมิอย่างช้า(3°C/นาที) พบว่าการใช้ DMSO 10% ที่ระดับอัตราการลดอุณหภูมิอย่างรวดเร็ว (10°C/นาที) มีเปอร์เซ็นต์การเคลื่อนที่ของสเปริม์หลังการละลายดีที่สุด และสามารถปฏิสนธิกับไข่ปลาตะเพียนขาวได้ไม่แตกต่างจากการใช้น้ำเชื้อสด อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (P>0.05) การแช่แข็งน้ำเชื้อปลาดุกอุยโดยใช้สารละลายบัฟเฟอร์ C –F HBSS และใช้สารไครโอโพรเทคแทนท์ที่มีความเป็นพิษน้อย 3 ตัว (propylene glycol, glycerol และ formamide) ที่ความเข้มข้น 4 ระดับ (5%, 10%, 15% และ 20%) โดยใช้อัตราการลดอุณหภูมิ 3 ระดับคืออัตราการลดอุณหภูมิอย่างรวดเร็ว (10°C/นาที), อัตราการลดอุณหภูมิอย่างปานกลาง (5°C/นาที) และอัตราการลดอุณหภูมิอย่างช้า(3°C/นาที) พบว่าการใช้ propylene glycol 15 %ที่อัตราการลดอุณหภูมิอย่างรวดเร็วมีเปอร์เซ็นต์การเคลื่อนที่ของสเปิร์มหลังการละลายดีที่สุด และสามารถปฏิสนธิกับไข่ปลาดุกอุยได้ไม่แตกต่างจากการใช้น้ำเชื้อสดอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ(P>0.05)