จุลินทรีย์ทะเลจากป่าชายเลน: แหล่งทางเลือกใหม่ของกรดไขมันไม่อิ่มตัวสูงที่ยั่งยืน

Abstract

การศึกษานี้ได้จัดแยกจุลินทรีย์ทะเลกลุ่มทรอสโทคิทริดส์จากใบไม้ป่าชายเลนที่ร่วงหล่นบริเวณป่าชายเลนภาคตะวันออกของประเทศไทย ได้แก่ ป่าชายเลนคลองโปรง จังหวัดชลบุรี ป่าชายเลนเจดีย์กลางน้ำ จังหวัดระยอง ป่าชายเลนอ่าวคุ้งกระเบน จังหวัดจันทบุรี และป่าชายเลนบ้านเปร็ดใน จังหวัดตราด จากจำนวนพันธุ์ไม้ทั้งหมด 20 ชนิด พบทรอสโทคิทริดส์ทั้งสิ้น 15 ชนิด (1,158 ไอโซเลท) โดยจำนวนและความหลากหลายชนิดของทรอสโทคิทริดส์ (รวมลาบิลินทูลิดส์) พบสูงสุดที่บ้านเปร็ดใน ซึ่งเท่ากับ 11 ชนิด (538 ไอโซเลท) รองลงคทอป่าชายเลนเจดีย์กลางน้ำ ป่าชายเลนอ่าวคุ้งกระเบนและป่าชายเลนคลองโปรง โดยมีจำนวนชนิดเท่ากับ 8 ชนิด (232 ไอโซเลท), 3 ชนิด (364 ไอโซเลท) และ 2 ชนิด (24 ไอโซเลท) ตามลำดับ ทรอสโทคิทริดส์ชนิดที่พบมากที่สุดคือ Schizochytrium mangrovei รองลงมาคือ S. limacinum การจัดจำแนกทรอสโทคิทริดส์อาศัยลักษณะทางสัณฐานวิทยา นอกจากนั้นยังนำเทคนิคทางอณูพันธุศาสตร์เข้ามาใช้ร่วมด้วยเพื่อการจัดจำแนกจุลินทรีย์กลุ่มนี้ โดยคัดเลือกทรอสโทคิทริดส์จำนวน 20 ไอโซเลท ซึ่งเป็นตัวแทนของทรอสโทคิทริดส์ทุกชนิดที่พบในการศึกษาครั้งนี้และนำมาวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน 18S rRNA จากนั้นลำดับนิวคลีโอไทด์ดังกล่าวมาวิเคราะห์วงศ์วานวิวัฒนาการ พบว่าทรอสโทคิทริดส์ทั้ง 20 ไอโซเลทกระจายอยู่ใน 2 clusters คือ Schizochyrtium cluster ซึ่งสมาชิกทั้งหมดอยู่ในสกุล Schizochytrium และ intergeneric thraustochytrid cluster โดยมีสมาชิกของทรอสโทคิทริดส์หลากหลายสกุล อย่างไรก็ตามมี ทรอสโทคิทริดส์ 2 สายพันธ์คือ BURABG162 และ BURGXT132 ที่ยังไม่สามารถจัดได้ว่าอยู่ในสกุลใด เนื่องจากข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน 18S rRNA ที่ปรากฏในฐานข้อมูลสาธารณะยังขาดความชัดเจนของการจัดจำแนก อย่างไรก็ตามลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน 18 rRNA ของ BURABG162 มีความคล้ายคลึงรวมทั้งมีสายวิวัฒนาการที่ใกล้ชิดกับทรอสโทคิทริดส์ในสกุล Schizochyrtium มากที่สุด ส่วนลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน 18 rRNA ของ BURABG132 มีความแตกต่างไปจากทรอสโทคิทริดส์สายพันธุ์อื่นๆ ที่คัดแยกได้ในบริเวณที่ศึกษาค่อนข้างมาก จากการศึกษาในครั้งนี้แสดงให้เห็นว่าการจัดจำแนกโดยอาศัยข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีน 18S rRNA มีความละเอียดและแม่นยำสูง แต่ก็มีข้อจำกัดเนื่องจากในปัจจุบันยังมีข้อมูลปรากฏอยู่ในฐานข้อมูลสาธารณะไม่มากนัก ซึ่งข้อมูลดังกล่าวยังขาดความหลากหลายและขาดความชัดเจนของการจัดจำแนก สำหรับทรอสโทคิทริดส์ที่คัดแยกได้นั้นได้นำมาศึกษาปริมาณกรดไขมันชนิดดีเอชเอ (Docosahexaenoic acid) ซึ่งพบสูงสุดในทรอสโทคิทริดส์ชนิด S. manarovei (116.48 ? 56.73 มิลลิกรัมต่อกรัมน้ำหนักแห้ง, 38.48 ? 10.42 เปอร์เซ็นต์ของกรดไขมันทั้งหมด) และ S. limacinum จากนั้นได้คัดเลือก S. mangrovei BUCARA 021 มาศึกษาสภาวะที่เหมาะสมต่อการเจริญและผลิตกรดไขมันไม่อิ่มตัวสูง โดยใช้สูตรอาหารเหลวในการเลี้ยงคือกลูโคสต่อยีสต์สกัด (6 : 1 %) เลี้ยงเป็นเวลา 8 วัน ที่อุณหภูมิ 15, 25 และ 35 องศาเซลเซียส และความเค็ม 5, 15 และ 25 ส่วนในพันส่วน ผลปรากฏว่าสภาวะที่เหมาะสมต่อการเจริญและผลิตกรดไขมันชนิดดีเอชเอของ S. manarovei BUCARA 021 คือเลี้ยงที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส ความเค็ม 15 ส่วนในพันส่วน เป็นเวลา 4 วัน โดยให้มวลชีวภาพ 17.67 กรัมต่อลิตร และปริมาณดีเอชเอ 115.16 มิลลิกรัมต่อกรัมน้ำหนักแห้ง (ผลผลิตดีเอชเอ 2,070.59 มิลลิกรัมต่อลิตร) ซึ่งทรอสโทคิทริดส์สายพันธุ์นี้มีศักยภาพสูงที่จะนำไปใช้ประโยชน์ต่อไป Screening and isolation of thraustochytrids from fallen senescent leaves of 20 mangrove trees collected from four mangrove areas located along the Eastern coast of the Gulf of Thailand, including Klong Prong, Chonburi Province; Jadee Klang Nam, Rayong Province; Kung Kra Ben Bay, Chantaburi Province; and Ban Pred Nai, Trad Province. A total of 1,158 thraustochytrid isolates were obtained, and they were classified into 15 diferent species. The most abundance and species diversity of thraustochytrids (and also Labyrinthulids) were found at Ban Pred Nai, which were accounted as 11 species of 538 isolates. The presence of thraustochytrids at Jadee Klang Nam, Kung Kra Ben Bay, and Klong Prong were demonstrated as 8 species (232 isolates), 3 species (364 isolates), and 2 species (24 isolates), respectively. In addition to morphology, the molecular techniques were also adopted for the identification of thraustochytrids. The nucleotide sequences of 18S rRNA gene of the twenty isolates of thraustochytrids, representing the overall picture if our collection, were analyzed and their phylogeny were reconstructed. According to the 18S rRNA gene tree, these isolates diverged into two major clusters, which were the Schizochytrium cluster and the intergeneric thraustochytrids cluster. However, the taxonomic group of two strains designated as BURABG162 and BUTRXG132 is still obscure since there are insufficient information regarding its identification based on 18S rDNA sequences. The BURABG162 was supposed to be a member of Schizochytrium according to its 18S rDNA sequence similarity and genetic distance. On the other hand, the identity of BUTRXG132 was not justified since its 18S rDNA sequence was much more different from the encompassed isolates and also the sequence obtained was too short to carry out the phylogenetic analysis simultaneously with other strains. Although the phylogenetic using the nucleotide sequences of 18S rRNA gene showed the taxonomic capability, the picture of molecular identification did not promising. This mainly resulted from lacking of nucleotide information in the public database. These thraustochytrids were screened for their docosahexaenoic acid (DHA: omega-3) production potential in glucose-yeast extract medium. High levels of DHA were revealed in S. mangrovei and S. limacinum, which represented as 116.48±56.73 mg/g dry weight (38.48±10.42% of total fatty acid) and 118.26±23.16 mg/g dry weight (37.83±6.89% of total fatty acid), respectively. Optimum conditions for the growth and production of DHA were explored in S. mangrovei BUCARA 021. This strain was grown in broth medium comprising glucose and yeast ectract (6:1 %) for 8 days. The influences of salinities (5, 15 and 25 ppt) and temperatures (15, 25 and 35 ̊C) were simultaneously evaluated. The results showed that the biomass of S. mangrovei BUCARA 021 produced was 17.67 g/L, while the DHA content was revealed as 115.16 mg/g dry weight. The highest yield of DHA (2,070.59 mg/L) was obtained from the 4-day culture incubated at 25 ̊C and 15 ppt salinity. It is indicated that this strain possesses the applicability for the production of polyunsaturated fatty acid and optimization for higher yields of DHA is possible.