แนวทางการผลิตวัคซีนต้านทานแบคทีเรียก่อโรคชนิด Vibrio vulnificus ในปลากะพงขาว

Abstract

ปลากะพงขาวที่ป่วยมีลักษณะแผลเปื่อย เกล็ดหลุด และตกเลือด จากฟาร์มในจังหวัดฉะเชิงเทรา ได้ถูกแยกเชื้อแบคทีเรียโดยวิธีทางจุลวิทยา และจำแนกชนิดด้วยชุดตรวจสอบ API 20E ชนิด Vibrio vulnifus และการศึกษาความแตกต่างทาง รูปร่างเซลล์ โคโลนี และทางชีวเคมี ทำให้แบ่งย่อยแบคทีเรียชนิดนี้ออกเป็น biotype 1 (ก่อโรคในคน) และ biotype 2 (ก่อโรคในปลา) ผลการทำลายเม็ดเลือดของคน คือ ชนิด biotype 1 มีการทำลายเม็ดเลือดแดงแบบ ß- haemolytic ส่วน biotype 2 มีการทำลายแบบ α- haemolytic ความรุนแรงในการก่อเชื้อโรคของแบคทีเรียต่อปลากะพงขาวได้ถูกยืนยันกลับโดยการฉีดแบคทีเรียเข้าสู่ปลากะพงขาวอีกครั้ง พบแบคทีเรียทั้งสอง biotype มีความรุนแรงใกล้เคียงกัน โดยอัตราการตายสะสมที่ 24 ชั่วโมงจำนวน 13 จาก 25 ตัว (52 %) และ 15 จาก 26 ตัว (58 %) หลังจากปลากะพงขาวรับเชื้อ V.vulnificus biotype 1 และ biotype 2 ตามลำดับ ณ 48 ชั่วโมง ปลามีการตายสะสม จำนวน 18 จาก 25 ตัว (72 %) และ 19 จาก 26 ตัว (73 %) หลังจากปลากะพงขาวรับเชื้อ V.vulnificus biotype 1 และ biotype 2 ตามลำดับ ลักษณะบาดแผลของปลากะพงขาวที่ตายในวันแรกๆ จากการรับเชื้อพบว่า ที่บริเวณท้องเป็นจุดแดงๆกระจายรอบเข็มฉีดยา และปลาที่ตาย ณ 96 ชั่วโมง มีบาดแผลเปื่อยเป็นวงแดงตกเลือด และท้องบวมน้ำ จากการศึกษาองค์ประกอบของโปรตีนในผนังของแบคทีเรียเรียกว่า outer membrane protein (OMP) จากแบคทีเรียทั้งสองสายพันธ์ โดยวิธีทางอิเลคโทรโฟลีลีส SDS-PAGE พบว่ามีความแตกต่างกันที่ขนาดโปรตีนหลัก โดย biotype 1 และ biotype 2 มีขนาดโปรตีนหลักของแบคทีเรียสองสายพันธุ์แตกต่างกันและความรุนแรงในการก่อเกิดโรคในระดับเดียวกัน การผลิตวัคซีนจึงออกแบบให้ได้จากแบคทีเรียผสมของทั้งสองสายพันธุ์ ผลการศึกษาประสิทธิภาพของวัคซีนแบบ formalin-killed vaccine (FKV) และ OMP vaccine ต่อปลากะพงขาวที่เลี้ยงในบ่อปูน ภายใน 5 สัปดาห์ พบว่า ปลากะพงขาวผลิตแอนติบอดีสูงสุดในสัปดาห์ที่ 2 และ 4 หลังการให้ วัคซีน FKV และ OMP ตามลำดับ วัดโดยเทคนิค Indirect ELISA และสูงกว่าชุดควบคุมให้น้ำเกลืออย่างมีนัยยะสำคัญ (p<0.05X สอดคล้องกับปริมาณเม็ดเลือดขาวที่สูง เมื่อทดสอบการคุ้มโรค จาก V.vulnificus ทั้งสองสายพันธุ์แล้ว ในสัปดาห์ที่ 6 พบว่า วัคซีน FKV มีอัตราการรอดตายสูง ที่ 93 เปอร์เซ็นต์ ส่วนปลาในกระชังที่เป็นเชิงพาณิชย์ ทดลอง 80 วัน พบว่า วัคซีน FKV มีการกระตุ้นแอนติบอลีสูงกว่าชุดควบคุมให้น้ำเกลืออย่างมีนัยยะสำคัญ (P<0.01) สอดคล้องกับเม็ดเลือดขาวที่สูง เมื่อทดสอบการคุ้มโรค จาก V.vulnificus ที่ 60 วัน พบว่า วัคซีน FKV มีอัตราการตายรอดตายหมดที่ 100 เปอร์เซ็นต์ และปลากะพงขาวได้รับวัคซีนจะรู้จักแอนติเจนจากเซลล์ที่ขนาด 17 KDa ผลการทดลองทั้งหมดชี้ให้เห็นว่า วัคซีน FKV ผสมทั้งสอง biotype น่าจะเป็นวัคซีนที่มีประสิทธิภาพสูงและการคุ้มโรคที่ดีจาก V.vulnificus

A primary isolation in the kidney of diseased sea bass, Lates calcarifer Bloch, (skin haemorrhage, wounds, slough scales) from a farm in Chachaengsao Province was performed on Tryptic Soy Agar supplemented with 2% MaCl. Two bacterial colonies were purified and identified by an API 20 E test kit, namely Vibrio vulnificus. Further biochemical characterization, it recognizes as being main to the human pathogen (biotype1) and fish pathogen (biotype2). The reactivity of lyzed human blood cells was observed and can divide into ß- haemolytic and α –haemolytic caused by biotype1 and biotype 2, respectively. The virulence of these two isolates to re-infect in sea bass was observed by injection to a total of 25 sea bass for each type. At 24 hours, the mortality rate was at 52% (13 from 25 individuals) and 58% (15 from 26 individuals) after biotype 1 and biotype 2 injection, respectively. At 48 hours, the mortality rate was 72% (18 from 25 individuals) and 73% (19 from 26 individuals) after injected with biotype 1 and biotype 2, respectively. The wound characteristics of dead fish after first few days showed red spots around injected target. As for 96 hours post injection, wounds appeared to be rotten with red bloody spots and swollen stomach. The outer member protein (OMP) protein pattern was studied between biotype 1 and biotype 2 analyzed using SDS-PAGE. A difference between the two biotype was the protein size. Mainly , biotype1 appears of protein weight of 36 KDa, as for biotype 2’s OMP molecular weight was at 34KDa. Vaccine development should consider virulence outcome and OMP composition. There should be potentially two different type of vaccines made from formalin-killed vaccine (FKV) and OMP vaccine (OMPV). Both vaccines composition should comprise of both bacterial type species. The antibody titer analyzed using indirect ELISA was measued in sea bass sera (Challengigng in cement pond) results in the highest lavel at week 2 and week 4 for FKV and OMP, repectively and significantly higher than (p<0.05) the saline injected control group. In addition, white blood cell count from both vaccenes support the response very high number. Higher protection was obtained against biotype 1 and biotype 2 challenge with relative percentage survival (RPS) at 93 % for the FKV only. Similar result of the FKV was via challenging in sea bass raised in the cage at Bangpakong River. The antibody level and white blood cell count of the FKV has significantly high than (P<0.01) the saline-injected control group. Higher protection was obtained against biotype1 and biotype2 with the RPA at 100%. Vaccine fish sera recognized a bacterial at 17 KDa. Overall study indicates the FKV has potential the best vaccine since it showed remarkable protaction against V.vulnificus.