โครงการการศึกษาลักษณะเบื้องต้นของโปรตีนชั้นผิวพยาธิใบไม้ตับ Fasciola gigantica ที่มีศักยภาพสูงสำหรับการพัฒนาการวินิจฉัยโรคพยาธิ fasciolosis

Abstract

พยาธิใบไม้ตับ Fasciola gigantica พบการระบาดในปศุสัตว์เขตร้อน ก่อให้เกิดโรค fasciolosis ปัจจุบันการวินิจฉัยการติดเชื้อทำได้โดยการตรวจหาไข่พยาธิในอุจจาระสัตว์ ซึ่งเป็นการตรวจหาพยาธิมนระยะตัวเต็มวัยเท่านั้น นักวิทยาศาสตร์จึงตรวจหา antigen ที่จำเพาะในซีรั่มของสัตว์ทดลอง เพื่อเป็นการตรวจวินิจฉัยตั้งแต่ในระยะแรกของการติดเชื้อ งานวิจัยในครั้งนี้จะเป็นการศึกษาลักษณะของ antigen ที่พยาธิหลั่งจากชั้นผิวของพยาธิระยะตัวอ่อนและระยะตัวเต็มวัย รวมทั้งศักยภาพที่จะนำไปวินิจฉัยการติดเชื้อพยาธิ โดยคัดเลือกโปรตีนของ tegumetnal antigen ที่ปล่อยเข้าสู่โฮสต์และกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันได้หลายวิธี western immunoblotting จากนั้นผลิต polyclonal antibody(PoAb) ที่ต้านต่อ antigen ดังกล่าว แล้วตรวจสอบความจำเพาะเจาะจงของ PoAbs ด้วยวิธี ELISA และ western immunoblotting จากนั้นนำ PoAbs ไปตรวจหาคุณลักษณะของ antigen ด้วย 1 และ 2 dimension gel electrophoresis นอกจากนั้นตรวจลักษณะ glycosylation โดยย้อมด้วยสี periodic acid Shciff (PAS) ตรวจผล cross reaction ของ antibody ในพยาธิต่างๆ ตรวจหาตำแหน่งของ antigen ภายในเนื้อเยื่อด้วยวิธี immunoperoxidase นอกจากนี้ตรวจหาลำดับกรดอะมิโนของโปรตีนที่สนใจด้วยวิธี Tandem Mass spectrometry และนำ polyclonal antibody ไปทดสอบความสามารถในการตรวจวินิจฉัยการติดเชื้อพยาธิเบื้องต้นด้วยวิธี direct ELISA ผลการศึกษาพบว่ามีแถบโปรตีนที่น่าสนใจ 4 แถบ คือ 16 kDa 21 kDa และ 36 kDa และสามารถสร้าง PoAbs ที่ต้านต่อโปรตีนทั้ง 4 แถบได้ แต่ PoAbs ที่ต้านต่อ 16 kDa ให้ผล cross reaction กับโปรตีนหลายตัว จึงเป็นโปรตีนที่ไม่น่าสนใจ และ PoAbs ที่ต่านต่อ 25 kDa และ 36 kDa ให้ผลจำเพาะเจาะจง จากการศึกษาด้วยวิธี PAS พบว่าโปรตีนทั้ง 4 ชนิด ให้ผลบวก แสดงว่ามีหมู่น้ำตาลอยู่ภายในโมเลกุลของโปรตีน จากการศึกษา cross reaction พบว่า PoAb ที่ต้านต่อ 21 kDs ให้ผล cross reaction กับพยาธิ Paramphistomum sp. และ PoAbs ที่ต้านต่อ 25 kDa ให้ผล cross reaction กับ Eurytrema pancreaticum จากการศึกษาตำแหน่งของโปรตีนในเนื้อเยื่อที่พบว่า 21 kDa สามารถตรวจพบได้บริเวณชั้นผิวของพยาธิตัวอ่อนและตัวเต็มวัย ในขณะที่ 16 kDa 25 kDa และ 36 kDa ส่วนใหญ่ สามารถพบได้บริเวณเนื้อเยื่อ parenchyma แสดงให้เห็นว่า antigen ที่น่าสนใจมากที่สุดคือ 21 kDa จากการศึกษาด้วยวิธี 2-DE western immunoblotting พบว่า PoAb ที่ต้านต่อ 21 kDa สามารถทำปฏิกิริยากับ antigen 2 จุด ซึ่งเมื่อนำไปตรวจหาลำดับกรดอะมิโน พบว่าโปรตีนทั้ง 2 จุด คิอ calcium binding protein และเมื่อนำ PoAb ที่ต้านต่อ 21 kDa ไปตรวจการติดเชื้อพยาธิในสัตว์ทดลอง พบว่า สามารถตรวจสอบการติดเชื้อได้ตั้งแต่สัปดาห์ที่3 ของการติดเชื้อ จากผลการทดลองแสดงให้เห็นว่า TA เป็น antigen ที่สำคัญ สามารถหลั่งจากตัวพยาธิและกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันของโฮสต์ได้ดี จากการศึกษาในครั้งนี้สามารถสรุปได้ว่า 21 kDa หรือ calcium binding protein เป็น antigen ที่มีศักยภาพสูงสุดที่น่าจะสามารถนำไปศึกษาเพื่อพัฒนาการตรวจวินิจฉัยการติดเชื้อพยาธิ F.gigantica ในอนาคตได้