การสร้างและผลิตรีคอมบิแนนท์แอนติบอดีที่มีความจำเพาะกับโปรตีนของ Fasciola gigantica ในเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมเพื่อพัฒนาชุดตรวจ

Abstract

Fasciola gigantica Glutathione peroxidase (FgGPx) จัดอยู่ในกลุ่มเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระและน่าจะมีศักยภาพในการพัฒนาเป็นโปรตีนเป้าหมายในการวินิจฉัยและวัคซีนโรค fasciolosis ในการศึกษาครั้งนี้ เรามุ่งมั่นที่จะโคลน ศึกษาคุณลักษณะ และศึกษาการแสดงออกของยีนและโปรตีนตัวนี้ FgGPx ถูกโคลนด้วย วิธีพีซีอาร์ (PCR) จาก สารพันธุกรรมของพยาธิตัวเต็มวัย (cDNA) ซึ่ง FgGPx DNA ประกอบด้วย 582 เบส และประกอบด้วยกรดอะมิโน 168 ตัวซึ่งมีน้ำหนักโมเลกุลเท่ากับ 19 กิโลดาลตัน โปรตีน recombinant FgGPx (rFgGPx) ถูกแสดงออกในแบคทีเรีย Escherichia coli BL21 (DE3) และนาโปรตีน rFgGPx ไป กระตุ้นให้หนูสร้างภูมิคุ้มกัน (แอนติบอดี) ต่อโปรตีน rFgGPx ชนิดโพลีโคลนอล (anti-rFgGPx) หลังจากนั้นนำแอนติบอดีที่ได้ไปทดสอบด้วยวิธี immunobloting กับ rFgGPx โปรตีนที่สกัดจากตัวพยาธิ (WB) โปรตีนที่สกัดจากผิว (TA) และโปรตีนที่พยาธิหลังออกมาจากทางเดินอาหาร (ES) พบว่ามีการให้ผลบวกกับโปรตีนที่ น้ำหนักโมเลกุล 19 กิโลดาลตันเฉพาะ rFgGPx WB และ TA เท่านั้น ไม่พบการแสดงออกใน ES รวมถึงได้ ทำการศึกษาการแสดงออกของโปรตีน FgGPx ของพยาธิใบไม้ตับ F. gigantica จำนวน 5 ระยะ คือ egg metacercariae, NEJ, 4 week-old juveniles และตัวเต็มวัยด้วยวิธี immunoblotting พบว่ายีน FgGPx มี การแสดงออกทุกระยะและมีการแสดงออกสูงในระยะไข่และตัวเต็มวัย และได้ศึกษาการแสดงออกของโปรตีน GPx ในเนื้อเยื่อของพยาธิตัวเต็มวัยด้วยวิธี immunohistochemistry พบว่ามีการแสดงออกของโปรตีน FgGPx ระดับสูงใน ผิวของพยาธิ (tegument) vitelline และไข่ นอกจากนี้ยังพบว่า แอนติบอดี (antirFgGPx) ไม่มีปฏิกิริยาข้ามกับแอนติเจน (GPx) กับพยาธิใบไม้ชนิดอื่น ๆ ได้แก่ Eurytrema pancreaticum, Cotylophoron cotylophorum, Fischoederius cobboldi, gastrothylax crumenifer, Paramphistomum cervi และ Setaria labiato papillosa จึงได้พัฒนาการวินิจฉัยโรคนี้ให้ดีขึ้น โดยการ ตรวจหาพยาธิ F.gigantica ด้วยวิธีการผลิต Monoclonal Antibody (MoAb) ต่อโปรตีน GPx ที่มี ความจาเพาะสูงในการวินิจฉัยโรคพยาธิใบไม้ตับจากการติดเชื้อ F.gigantica โดยวิธี Hybridoma Technique จากการนาม้ามของหนูที่ผ่านการ immunization ด้วย FgGPx (Ag) มาทาการ Fusion กับ Myeloma แล้วนำเซลล์ไปเลี้ยง (Cell culture) ศึกษาปริมาณ MoAb ด้วยวิธี Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) แล้ววัดความเข้มข้นของ Ab ที่ความยาวคลื่น 450 นาโนเมตร จึงทำการเช็คชนิด (isotype) ของ MoAb (clone 7B8) ต่อ recombinant Fasciola gigantica GPx (rFgGPx) พบว่า เป็นชนิด immunoglobulin (Ig) G1 with  light chain ศึกษาความจำเพาะของโปรตีน FgGPx ต่อโปรตีน tegument antigen (TA), whole body (WB) และ excretory-secretory (ES) ด้วย indirect western blot พบว่าโปรตีน FgGPx มีความจำเพาะต่อโปรตีนที่ผิว (TA) และโปรตีนที่สกัดจากทั้งตัว(WB) ของพยาธิ F.gigantica ทั้งสองมีน้ำหนักโมเลกุลอยู่ที่ประมาณ 19 kDa ไม่มีปฏิกิริยาข้ามกับพยาธิชนิดอื่น ๆ ได้แก่ Paramphistomum cervi, Gigantocotyle explanatum, Cotylophoron cotylophorum, Gastrothylax crumenifer, Setaria labiatopapillosa, Eurytrema pancreaticum และ Fischoederius cobboldi และศึกษาการแสดงออกของโปรตีน FgGPx ด้วยวิธี Immunohistochemistry ระยะ metacercariae ไม่พบการแสดงออกของโปรตีน GPx แต่ในระยะ 3 สัปดาห์, 4 สัปดาห์ และตัวเต็มวัย (Adult) พบว่ามีการแสดงออกของ GPx ที่ผิว (tegument) ของพยาธิ F.gigantica ดังนั้นงานวิจัยนี้จึงเป็นการ ผลิต MoAb ต่อ rFgGPx เพื่อพัฒนาเป็นชุดตรวจในการวินิจฉัยเชื้อพยาธิใบไม้ตับ F.gigantica ต่อไปในอนาคต รวมถึงได้ผลิตและศึกษาคุณลักษณะของ Monoclonal antibody (MoAb) ต่อโปรตีน thioredoxinrelated Protein 14 kDa (FgTRP14) ของพยาธิใบไม้ตับ F. gigantica ด้วยเพื่อนำ monoclonal antibody ที่ได้มาพัฒนาชุดตรวจวินิจฉัยการติดเชื้อ F. gigantica ในการศึกษาครั้งนี้ได้นา Hybridoma cell มาเลี้ยงเซลล์เพื่อเพิ่มจำนวน hybridoma cells และปริมาณแอนติบอดีในน้ำเลี้ยงเซลล์ จากนั้นนำ culture fluid มาทดสอบหาปริมาณของ MoAb แล้วนา MoAb ที่ให้ค่าดูดกลืนแสงสูงมาทำการตรวจสอบชนิดของ MoAb ด้วยวิธี indirect ELISA พบว่ามี heavy chain เป็นชนิด IgM และมี light chain เป็นชนิด Lambda ทั้งหมด 5 clone ได้แก่ 1B2-2, 2D2, 4F3, 5G8 และ 5G8-2 จากนั้นนำมาทดสอบความสามารถของ MoAb ในการจับ TRP14 ด้วยวิธี western blot โดยใช้ polyclonal antibody (PoAb) เป็น positive control และใช้ myeloma cell เป็น negative control พบว่า MoAb 4 clone ได้แก่ 2D2, 5G8, 4F3 และ 1B2-2 มีความจำเพาะต่อ TRP14 ที่ 14 kDa และทำการศึกษา MoAb clone 2D2 ต่อ Fasciola gigantica whole blood Fg (WB), excretory-secretory (ES) และ tegumental antigens (TA) พบว่ามีความจำเพาะต่อ Fg (WB) และ ES ที่ 14 kDa แต่ไม่มีความจำเพาะต่อ TA และทำการทดสอบปฏิกิริยาข้ามกัน (cross reaction) กับโปรตีนของพยาธิชนิดต่าง ๆ Fasciola gigantica (Fg), Schistosoma mansoni (Sm), Opisthorchis viverrini (Ov), Cotylophoron cotylophorum (Cc), Seratia Iabiatopapillosa (Si), Paramphistonum cervi (Pc), Gastrothylax crumenifer (Gc), Eurytrema pancreaticum (Ep), Giganocytyle explanum (Ge) พบว่า MoAb ทั้ง 4 clone ไม่มีการเกิด cross reaction กับพยาธิชนิดอื่น ๆ โดยผลที่ได้สามารถนำไปพัฒนาเป็นชุดตรวจวินิจฉัยการติดเชื้อพยาธิ F. gigantica ตั้งแต่ระยะเริ่มแรกของการติดเชื้อได้ ดังนั้นมีความเป็นไปได้ที่จะใช้ rFgGPx และ rFgTRP14 เพื่อเป็นโปรตีนเป้าหมายในการวินิจฉัยโรคและหรือวัคซีนสำหรับโรค fasciolosis ในสัตว์เศรษฐกิจและมนุษย์ในอนาคต