การเพิ่มศักยภาพการผลิตพลาสติกชีวภาพกลุ่มพอลีไฮดรอกซี อัลคาโนเอตในรูปโฮโมพอลิเมอร์และโคพอลิเมอร์จากแบคทีเรีย Alcaligenes latus ที่คัดเลือกจากการเหนี่ยวนำให้เกิดการกลาย

Abstract

Polyhydroxyalkanoates (PHAs) การผลิตพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอตจากเชื้อ Alcaligenes latus TISTR 1403 และสายพันธุ์กลาย คือ BOT I และ BOT II ที่เลี้ยงในอาหารดัดแปลงที่เหมาะสมสำหรับกระบวนการชีวสังเคราะห์และการสะสมพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอต พบว่าเชื้อ A. latus สายพันธุ์ BOT II ในอาหารสูตรดัดแปลงจาก DSMZ catalogue สามารถผลิตมวลเซลล์แห้งและปริมาณพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอตได้สูงสุดเท่ากับ 5.90±0.20 และ 4.10±0.10 กรัมต่อลิตร คิดเป็นร้อยละ 69.49 ของน้ำหนักมวลเซลล์แห้ง เมื่อใช้น้ำมันถั่วเหลืองความเข้มข้น 20 และ 60 กรัมต่อลิตรเป็นแหล่งคาร์บอนทดแทนน้ำตาลฟรุคโตส พบว่าเชื้อนี้สามารถผลิตพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอตได้ร้อยละ 90 ของน้าหนักเซลล์แห้ง ส่วนการเลี้ยงด้วยน้ำมันถั่วเหลือง 40 กรัมต่อลิตร แบคทีเรียสามารถผลิตพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอตได้ร้อยละ 75 ของน้ำหนักเซลล์แห้ง ซึ่งมีค่าสูงกว่าชุดควบคุมที่ใช้ฟรุคโตส (ร้อยละ 65 ของน้ำหนักเซลล์แห้ง) ในการใช้แหล่งคาร์บอนและแหล่งไนโตรเจนที่เหมาะสมในอาหารดัดแปลงทั้งหมด 3 ชุด พบว่าอาหารดัดแปลงชุดที่ 3 ที่มีน้ำมันถั่วเหลืองความเข้มข้น 40 กรัมต่อลิตร ร่วมกับการใช้ผงชูรส 0.5 กรัมต่อลิตร สามารถผลิตมวลเซลล์แห้งได้สูงสุด 3.47±0.15 กรัมต่อลิตร สามารถผลิตพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอตได้สูงสุด 2.63±0.06 กรัมต่อลิตร คิดเป็นร้อยละ 75.79 ของมวลเซลล์แห้ง ในการใช้ผงชูรสเป็นแหล่งไนโตรเจนทดแทนที่ความเข้มข้นเท่ากับ 0.5, 2, 4 และ 6 กรัมต่อลิตร พบว่าการใช้ผงชูรส 2 กรัมต่อลิตร A. latus สายพันธุ์ BOT II สามารถผลิตมวลเซลล์แห้ง และปริมาณพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอตได้สูงสุด เท่ากับ 4.53±0.32 และ 3.10±0.06 กรัมต่อลิตร คิดเป็นร้อยละ 68.43 ของมวลเซลล์แห้ง ซึ่งมีค่าต่ากว่าการใช้แอมโนเนียมคลอไรด์ต่อผงชูรสอัตราส่วน 0.25:2 กรัมต่อลิตร สามารถผลิตมวลเซลล์แห้ง และปริมาณพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอต ได้สูงสุด เท่ากับ 5.90±0.20 และ 4.10±0.10 กรัมต่อลิตร ตามลำดับ คิดเป็นร้อยละ 69.49 จากการเติมสารตั้งต้นเพื่อเพิ่มความสามารถในการผลิตพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอตในรูปโคพอลิเมอร์ของเชื้อ A. latus BOT II โดยเลี้ยงในอาหารดัดแปลงซึ่งเติมสารตั้งต้นที่มีผลต่อการสร้างโคพอลิเมอร์ 3 ชนิด คือ แกมม่า บิวทาโรแลกโตน 1,4 บิวเทนไดออล และกรดวาเลอริก พบว่าการเลี้ยงแบคทีเรียด้วยอาหารดัดแปลงที่เติม 1,4 บิวเทนไดออล ผลิตมวลเซลล์แห้งได้สูงสุด 7.30±0.20 กรัมต่อลิตร และให้พอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอต ได้เท่ากับ 6.00±0.10 กรัมต่อลิตร คิดเป็นร้อยละ 82.19 ของน้ำหนักเซลล์แห้ง จากนั้นได้เลี้ยงแบคทีเรียด้วยน้ำมันต่าง ๆ ได้แก่ น้ำมันถั่วเหลือง น้ำมันปาล์ม น้ำมันข้าวโพด น้ำมันทานตะวัน และน้ำมันราข้าว เป็นแหล่งคาร์บอนทดแทนร่วมกับการเติมสาร 1,4 บิวเทนไดออล พบว่าการใช้น้ำมันราข้าวร่วมกับ 1,4 บิวเทนไดออล มีผลต่อการผลิตพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอตเพิ่มขึ้นเป็นร้อยละ 87.85 ของน้าหนักเซลล์แห้ง ในขณะที่การใช้น้ำมันถั่วเหลืองและน้ามันปาล์ม ผลิตพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอตได้น้อยกว่า คิดเป็นร้อยละ 79 ของน้าหนักเซลล์แห้งอย่างไรก็ตาม การใช้น้ำมันปาล์มซึ่งมีราคาถูกกว่าน้ามันชนิดอื่น ๆ ร่วมกับการเติม 1,4 บิวเทนไดออลที่ความเข้มข้นต่าง ๆ คือ ร้อยละ 15, 25,50 และ 75 (โดยน้ำหนักต่อปริมาตร) ของแหล่งคาร์บอน พบว่า การเติม 1,4 บิวเทนไดออลความเข้มข้นร้อยละ 50 สามารถ ผลิตมวลเซลล์แห้งและปริมาณพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอตได้สูงสุด เท่ากับ 7.10±0.20 และ 5.63±0.15 กรัมต่อลิตร คิดเป็นร้อยละ 79.30 ของน้ำหนักเซลล์แห้ง ส่วนการเลี้ยงด้วยแหล่งคาร์บอนประเภทน้ำตาลร่วมกับสารตั้งต้นเพื่อการผลิตโคพอลิเมอร์ พบว่าน้ำตาลฟรุคโตสความเข้มข้น 20 และ 40 กรัมต่อลิตร สามารถผลิตพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอตได้ร้อยละ 83 ของน้ำหนักเซลล์แห้ง และน้ำตาลเด็กซ์โตรสความเข้มข้น 20 และ 40 กรัมต่อลิตร สามารถผลิตพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอตได้ร้อยละ 81 ของน้ำหนักเซลล์แห้งการศึกษาการสกัด สาหรับวิธีการสกัดพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอตในรูปของกรดโครโตนิก 4 วิธี ได้แก่ วิธีการสกัดพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอตด้วยวิธีคลอโรฟอร์ม วิธีการสกัดพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอตด้วยไฮโปคลอไรท์ร่วมกับคลอโรฟอร์ม วิธีการสกัดพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอตด้วยไฮโปคลอไรท์ และวิธีการสกัดพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอตด้วยไฮโปคลอไรท์ที่อุณหภูมิและเวลาแตกต่างกัน พบว่าการสกัดพอลิไฮ ดรอกซีอัลคาโนเอตด้วยวิธีไฮโปรคลอไรท์ที่อุณหภูมิและเวลาแตกต่างกัน ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 10 นาที ได้ปริมาณพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอตสูงสุด เท่ากับ 3.22±0.03 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ในการศีกษาเพื่อพัฒนาวิธีการสกัดพลาสติกชีวภาพชนิดพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอต โดยการใช้การสกัดด้วยคลอโรฟอร์ม ไฮโปคลอไรท์ และไฮโปคลอไรท์ร่วมกับคลอโรฟอร์ม การศึกษาอัตราส่วนที่เหมาะสมต่อการย่อยด้วยกรดซัลฟูริก เพื่อการวิเคราะห์ปริมาณของพอลิไฮดรอกซีอัลคาโนเอตในรูปของกรดโครโตนิกของเชื้อ A. latus BOT II พบว่า การสกัดด้วยไฮโปคลอไรท์ ที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 20 นาที และใช้อัตราส่วนกรดซัลฟูริกต่อตัวอย่าง 1: 1 เป็นวิธีการที่เหมาะสมโดยใช้ให้ปริมาณพอลิไฮดรอกซีบิวทิเรต เท่ากับ 171.81 ± 3.34 มิลลิกรัมต่อลิตร จากการขยายขนาดการเลี้ยงไปสู่ระดับถังปฏิกรณ์ชีวภาพขนาด 5 ลิตร ด้วยการเลี้ยงแบบกะ เชื้อ A. latus BOT II สามารถผลิตน้ำหนักเซลล์แห้งและ PHAs ได้ผลผลิตเท่ากับ 8.60±0.20 และ 6.87±0.57 กรัมต่อลิตร (ร้อยละ 79.88 ของน้ำหนักเซลล์แห้ง) ที่ระยะเวลาการเลี้ยง 30 ชั่วโมง จากการนามาตรวจสอบชนิดของโฮโมพอลิเมอร์และโคพอลิเมอร์ โดยใช้สารมาตรฐาน Poly(3-hydroxybutyrate -co-3-hydroxyvalerate) เป็นสารอ้างอิง เมื่อนำไปวิเคราะห์ด้วยเครื่อง GCMS และนาโครมา โตรแกรมที่ได้ไปเทียบกับมวลสเปคตรัม จาก Library search wiley7n.l พบโครมาโตแกรมที่น่าสนใจ เป็นสารดังนี้คือ dimethylsiloxane cyclic trimer, 2-Butanoic acid, 5 hydroxyhexanoic acid-methyl ester, methoxy phenyl oxime, octamethylcyclotetrasiloxane, methyl benzoate และ decamethyl cyclopentasiloxane ตามลำดับ