การผลิตอัลคาไลน์โปรตีเอสจากเชื้อแบคที่เรียที่คัดแยกได้จากดินภายใต้สภาวะการหมักแบบเติมกะ

Abstract

แบคทีเรียที่มีความสามารถในการผลิตเอนไซม์อัลคาไลน์โปรตีเอสซึ่งคัดแยกได้จากตัวอย่างดินภายในประเทศ สายพันธุ์ Bacillus cohnii มีประสิทธิภาพในการสร้างเอนไซม์ดีที่สุด เมื่อใช้อาหารสูตร BPMM พีเอช 10 ที่มีเด็กซ์ทรินเป็นแหล่งคาร์บอนและกากถั่วเหลืองเป็นแหล่งไนโตรเจน ภายใต้อุณหภูมิ 37 ºC เมื่อศึกษาเปรียบเทียบประสิทธิภาพของเทคนิคในการเพาะเลี้ยง B. cohnii สำหรับ การผลิตอัลคาไลน์โปรตีเอสในถังหมักขนาด 5 ลิตร พบว่า B. cohnii มีประสิทธิภาพในการผลิตเอนไซม์สูงสุด เมื่อเพาะเลี้ยงด้วยเทคนิคการเพาะเลี้ยงแบบเติมกะ โดยใช้อาหารเพาะเลี้ยง BPMM พีเอช 10 ที่มีเด็กซ์ทรินเป็นแหล่งคาร์บอนและกากถั่วเหลืองเป็นแหล่งไนโตรเจน ความเข้มข้น 2 เท่า ไม่มีการเติมสับสเตรทและไม่มีการควบคุมค่าพีเอช อุณหภูมิ 37 ºC อัตราการให้อากาศ 1 vvm ความเร็วใบกวน 500 rpm เติมอาหารที่ระยะ deceleration phase ด้วยอาหารที่มีองค์ประกอบและความเข้มข้นเดียวกันกับในถังหมัก อัตราคงที่ที่ 0.65 L/h ทาให้สามารถวัดค่าอัตราการเจริญจาเพาะ (μ) ได้ 0.124 h-1 อัตราการจำเพาะของการสร้างเอนไซม์ (qp) ได้ 1.785 U/g cell.h ค่ากิจกรรมเอนไซม์และอัตราการสร้างเอนไซม์สูงสุดเท่ากับ 9.51 U/mL และ 0.396 U/mL/h ตามลาดับ โดยค่าที่วัดได้สูงกว่าเทคนิคการเพาะเลี้ยงแบบกะถึง 1.6 เท่า เมื่อนำเอนไซม์ไปตกตะกอนด้วยแอมโมเนียมซัลเฟตที่ความเข้มข้นอิ่มตัวร้อยละ 60-80 ทาให้ได้กิจกรรมจำเพาะของเอนไซม์สูงสุดมีค่าเท่ากับ 1.93 ยูนิตต่อมิลลิกรัมโปรตีน และเอนไซม์มีความบริสุทธิ์เพิ่มขึ้น 1.7 เท่า อัลคาไลน์โปรตีเอสที่ผ่านการทำบริสุทธิ์บางส่วนด้วยวิธีนี้ สามารถทางานได้ดีในช่วงพีเอชประมาณ 9.5 ถึง 11 โดยมีค่าพีเอชที่เหมาะสมต่อกิจกรรมการทางานที่พีเอช 10 และมีเสถียรภาพในช่วงพีเอชที่กว้างระหว่าง 7-12 อุณหภูมิที่เหมาะสมต่อการทำงานของเอนไซม์คือ 70 องศาเซลเซียส และมีเสถียรภาพต่ออุณหภูมิในช่วง 30 ถึง 50 องศา เซลเซียส สามารถถูกยับยั้งการทำงานได้โดยสาร EDTA ที่ความเข้มข้น 10 mM ส่วนสาร PMSF และ 1,10-phenantroline มีผลยับยั้งกิจกรรมของเอนไซม์อัลคาไลน์โปรตีเอสได้ประมาณ 30 เปอร์เซ็นต์ที่ความเข้มข้น 10 mM นอกจากนี้ ยังพบว่าเอนไซม์ยังความคงตัวอยู่ได้ในสภาวะที่มีสารลดแรงตึงผิว ชนิดที่ไม่มีประจุ (Nonionic surfactant) และสารฟอกขาว ได้แก่ triton x-100, tween 80 และ H2O2 ที่ความเข้มข้นทั้ง 0.5 และ 1 เปอร์เซ็นต์ ภายใต้สภาวะที่มีไอออนของโลหะ Mn2+, Zn2+, Cu2+, Ca2+, Fe2+ และ Mg2+ ที่ความเข้มข้น 1 มิลลิโมลาร์ จะทำให้เอนไซม์มีกิจกรรมเพิ่มสูงขึ้น