การพัฒนาโมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อไวเทลโลเจนินในพลาสมา ของปลากะพงขาว (Lates calcarifer Bloch)

Abstract

พอลิโคลนอลแอนติบอดีจำเพาะต่อไวเทลโลเจนินจากพลาสมาปลากะพงขาวถูกผลิตขึ้นโดยนาไวเทลโลเจนิน บริสุทธิ์จากพลาสมาของปลากะพงขาวที่ได้รับการฉีดกระตุ้นด้วยฮอร์โมน 17β-estradiol (E2) มาใช้เป็นแอนติเจนสาหรับฉีดกระตุ้นภูมิคุ้มกันในหนูเมาส์สายพันธุ์ BALB/c 3 ตัว จำนวน 3 ครั้ง แต่ละครั้งห่างกัน 2 สัปดาห์ หลังจากฉีดกระตุ้นจำนวน 4 ครั้ง เป็นเวลา 7 วัน เก็บแอนติซีรัมจากหนูเมาส์ (PAb-seabass VTG) มาตรวจสอบความจำเพาะกับไวเทลโลเจนิน บริสุทธิ์จากพลาสมาของปลากะพงขาว โดยเทคนิค western blot เทคนิค dot blot และเทคนิค Immunohistochemistry และตรวจสอบปฏิกิริยาข้ามกับโปรตีนในเลือดปลานิลและปลาเก๋าปะการังที่ได้รับการฉีดกระตุ้นด้วย E2 โดยเทคนิค western blot พบว่า PAb-sea bass VTG ที่ได้จากหนูทั้ง 3 ตัว สามารถจับกับไวเทลโลเจนินบริสุทธิ์จากปลากะพงขาว ขนาด 169, 132, 112 และ 86 กิโลดาลตัน ได้ และสามารถแสดงผลของปฏิกิริยาสีน้ำตาลอ่อน กับไวเทลโลเจนินในเนื้อเยื่อตับ ม้าม และลำไส้ ของปลากะพงขาววัยอ่อนที่ได้รับการฉีดกระตุ้นด้วย E2 และในการทดสอบปฏิกิริยาข้ามพบเพียงพอลิโคลนอลแอนติบอดีจากหนูตัวที่ 2 ที่เกิดปฏิกิริยาข้ามกับโปรตีนในพลาสมาปลานิลและปลาเก๋าปะการังที่ได้รับการฉีดกระตุ้นด้วย E2 ขนาด 210 และ 140 กิโลดาลตัน ซึ่งแสดงให้เห็นว่า PAb-sea bass VTG จากหนูตัวที่ 2 สามารถนำไปใช้ตรวจสอบไวเทลโลเจนินและประยุกต์ใช้ตรวจสอบในปลานิลและปลาเก๋าปะการังได้ เมื่อนาม้ามจากหนูทั้ง 3 ตัวไปหลอมเซลล์เพื่อผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีได้จำนวน 3 ครั้ง ได้โมโนโคลนอลแอนติบอดีรวมทั้งสิ้น 11 โคลน เพื่อทำการตรวจสอบลักษณะสมบัติของแอนติบอดีต่อไป Polyclonal antibody specific to vitellogenin was produced using Vitellogenin (VTG) purified from plasma of E2 treated Asian sea bass as antigen. Three ICR mice were immunized for 3 times at 2 weeks interval. Seven days after last immunization, mice antiserum were collected and tested specificity with purified VTG by western blot, dot blot and immunohistochemistry and tested cross reactivity with plasma of E2 treatment Tilapia and coral grouper by western blot. All 3 mice antiserum showed the specificity with purified Asian sea bass plasma VTG at 169, 132,112 and 86 kDa and with plasma VTG in tissues of internal organs by showing pale brown in liver, spleen and intestine tissues of E2 treatment juvenile sea bass. In cross-reactivity testing with E2 treatment tilapia plasma, only PAb-sea bass VTG from mouse no.2 showed the cross-reactivity with Tilapia and coral grouper plasma protein. This conclude that the PAb-sea bass VTG from mouse no.2 was applicable for use in VTG detection not only in Asian sea bass but also in tilapia and coral grouper as well. All three mice were further use for fusion in monoclonal antibody production protocol. Results from 3 fusions, there are 11 clones of monoclonal antibody specific to Asian seabass vitellogenin for further characterization.