การพัฒนาการผลิตวัคซีนและสารเสริมอาหารโดยเทคนิคการตรึงเพื่อกระตุ้นภูมิคุ้มกันของปลาทะเลต่อปรสิตสัตว์น้ำหรือแบคทีเรีย

สุพรรณี ลีโทชวลิต; จันทร์จรัส วัฒนะโชติ; จารุนันท์ ประทุมยศ

dc.contributor.author	สุพรรณี ลีโทชวลิต
dc.contributor.author	จันทร์จรัส วัฒนะโชติ
dc.contributor.author	จารุนันท์ ประทุมยศ
dc.contributor.other	มหาวิทยาลัยบูรพา. สถาบันวิทยาศาสตร์ทางทะเล
dc.date.accessioned	2019-03-25T09:09:59Z
dc.date.available	2019-03-25T09:09:59Z
dc.date.issued	2559
dc.identifier.uri	http://dspace.lib.buu.ac.th/xmlui/handle/1234567890/1943
dc.description.abstract	จากการศึกษาการเลี้ยงยีสต์ P. jadinii ในอาหารเลี้ยงเชื้อกากชานอ้อยที่ความเค็ม 25 พีพีที เป็นเวลา 96 ชั่วโมง มีการเจริญสูงสุดในระยะเวลาการเลี้ยงที่ 72 ชั่วโมง และมีจำนวนเซลล์เท่ากับ 2.45 x 108 เซลล์ต่อมิลลิลิตร จากการวิเคราะห์ชนิดและปริมาณกรดไขมันจากเม็ดเจลที่ตรึงยีสต์ Pichia sp. ด้วยแคลเซียมอัลจิเนต พบกรดปาล์มิติกเป็นองค์ประกอบหลักมากที่สุดร้อยละ 21.20 ± 0.57 กรดโอเลอิกและกรดไลโนเลอิกร้อยละ 17.83 ± 0.35 และ 3.14 ± 0.10 ตามลำดับ ในขณะที่พบกรดไขมันอิ่มตัวและกรดไขมันไม่อิ่มตัวเชิงเดี่ยวทั้งหมดในเม็ดเจลแห้งร้อยละ 32.16 และ 20.36 ตามลำดับ หลังจากนั้นนำ P. jadinii และปรสิต Cryptocaryon irritans ที่เก็บรวบรวมได้ปริมาณมากนำมาทดสอบชนิดของวัสดุและวิธีการตรึงเซลล์ เพื่อไม่ให้ละลายออกมาในน้ำ พบว่าสามารถตรึงตัวอย่างได้ด้วย โซเดียมอัลจิเนตเข้มข้นร้อยละ 1.2 และแคลเซียมคลอไรด์ร้อยละ 1.5 ต่อมานำอาหารที่ผลิตได้มาทดสอบต่อการเปลี่ยนแปลงระบบภูมิคุ้มกันเบื้องต้นของปลากะพงขาว (Lates calcarifer) ที่ให้กินอาหารทดลองหลายสูตรต่อการต้านทานปรสิตชนิด C. irritans โดยวางแผนการทดลองแบบสุ่มตลอด (4x3 Completely Randomised Design) อาหารทดลองประกอบด้วยอาหารเม็ดชนิดจมน้ำ 4 สูตร อาหารสูตรที่ 1 อาหารชุดควบคุมประกอบด้วยสูตรอาหารปลากะพง สูตรที่ 2 ประกอบด้วยอาหารชุดควบคุมผสม C. irritans ระยะ theront เชื้อตาย สูตรที่ 3 ประกอบด้วยอาหารปลาชุดควบคุมผสมยีตส์ P. jadinii สูตรที่ 4 ประกอบด้วยอาหารชุดควบคุมผสม Sodium alginate อาหารทุกสูตรมีปริมาณโปรตีน 49-51 เปอร์เซ็นต์ และปริมาณไขมัน 12-13 เปอร์เซ็นต์ ทำการทดลองในปลากะพงขาวน้ำหนักเริ่มต้นเฉลี่ย 6.21 ± 0.79 กรัมและความยาวเฉลี่ย 8.15 ± 0.58 เซนติเมตร ให้ปลากินอาหาร 3 เปอร์เซ็นต์ของน้ำหนักตัวตลอดการทดลอง 4 สัปดาห์ โดยให้ปลากินอาหารทดลองแต่ละสูตรเป็นเวลา 2 สัปดาห์แรกของการทดลองหลังจากนั้นเปลี่ยนให้ปลาทุกชุดการทดลองกินอาหารชุดควบคุมต่อไปอีกเป็นเวลา 2 สัปดาห์ เมื่อสิ้นสุดการทดลอง นำปลากะพงขาวจำนวน 30 ตัวต่อชุดการทดลองไปเผชิญเชื้อ C. irritans ระยะ theront จำนวน 15,000 เซลล์/ปลา 1 ตัว พบว่าปลาที่กินอาหารสูตรที่ 1 และ 2 มีอัตราการรอดตายร้อยละ 83 และปลาที่กินอาหารสูตร 3 และ 4 มีอัตราการรอดตายร้อยละ 93 และ 90 ตามลำดับ เมื่อนำมาวิเคราะห์หาค่าเปอร์เซนต์รอดตายสัมพัทธ์ (RPS) พบว่าปลากะพงขาวที่กินอาหารสูตร 3 มีค่า RPS สูงสุดที่ 59 ในระหว่างการทดลองทำเก็บตัวอย่างเลือดปลาเริ่มต้นการทดลอง ตัวอย่างเลือดปลากินอาหารทดลองเป็นระยะเวลา 2 สัปดาห์ ตัวอย่างเลือดปลาที่กินอาหารชุดควบคุมหลังจากกินอาหารทดลอง 2 สัปดาห์ และตัวอย่างเลือดปลาหลังจากเผชิญเชื้อเป็นระยะเวลา 3 7 และ 14 วัน เพื่อทำการตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงของระบบภูมิคุ้มกันเบื้องต้น ได้แก่ กิจกรรมไลโซไซม์ในซีรั่ม ปลาที่กินอาหารสูตรที่ 2 และ 3 ที่มีปรสิตและยีสต์เป็นองค์ประกอบมีปริมาณไลโซไซม์สูงกว่าปลากินอาหารชุดควบคุม และมีปริมาณไลโซไซม์ในซีรั่มสูงสุดในสัปดาห์ที่ 4 ของการทดลอง เมื่อตรวจวัดระดับแอนติบอดีในซีรั่มปลากะพงขาวโดยเทคนิค ELISA พบว่าปลาที่กินอาหารที่มีปรสิตและยีสต์เป็นองค์ประกอบเป็นเวลา 2 สัปดาห์ มีแนวโน้มของระดับของแอนติบอดีสูงกว่าปลาที่กินอาหารชุดควบคุมและอาหารที่มีโซเดียมอัลจิเนตเป็นองค์ประกอบ โดยที่ระดับแอนติบอดีในซีรั่มปลาที่ได้รับการกระตุ้นด้วยปรสิตและยีสต์มีค่าใกล้เคียงกันเมื่อสิ้นสุดการทดลองที่ 4 สัปดาห์ ส่วนปริมาณโปรตีนในซีรั่มปลากะพงพบว่าเพิ่มขึ้นเมื่อระยะเวลาการเลี้ยงนานขึ้น โดยเฉพาะปลาที่กินอาหารสูตรที่ 2 3 และ 4 และเมื่อให้ปลาเผชิญเชื้อแล้วเป็นเวลา 3 7 และ 14 วัน พบว่าแนวโน้มของระดับแอนติบอดีของปลาที่กินอาหารสูตรที่ 1 2 และ 3 สูงขึ้น ส่วนระดับแอนติบอดีของปลาที่กินอาหารสูตรที่ 4 ค่อนข้างคงที่ตลอดการทดลอง แต่เมื่อปรากฏจุดขาวขึ้นที่ตัวปลาหลังจากเผชิญเชื้อแล้ว 7 วัน ระดับแอนติบอดีของปลาสูงขึ้นในทุกชุดการทดลองซึ่งตรงกันข้ามกับปริมาณโปรตีนในซีรั่มที่มีแนวโน้มลดลง อย่างไรก็ตามปลาที่เลี้ยงด้วยอาหารสูตรที่มี C. irritans ระยะ theront เชื้อตายเป็นส่วนผสมมีปริมาณโปรตีนในซีรั่มสูงกว่าในปลาที่เลี้ยงด้วยอาหารชุดควบคุม ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าปรสิต C. irritans ระยะ theront เชื้อตาย และยีสต์ P. jadinii สามารถกระตุ้นให้ปลาตอบสนองต่อแอนติเจนโดยสร้างแอนติบอดีเพิ่มขึ้น การทดลองศึกษาการเปลี่ยนแปลงระบบภูมิคุ้มกันเบื้องต้นของปลาการ์ตูนส้มขาว (Amphiprion ocellaris) ที่ให้กินอาหารทดลอง 4 สูตรต่อการต้านทานปรสิตชนิด Cryptocaryon irritans โดยวางแผนการทดลองแบบสุ่มตลอดเช่นเดียวกับปลากะพงขาว อาหารทดลองประกอบด้วยอาหารเม็ดชนิดจมน้ำ 4 สูตร อาหารสูตรที่ 1 อาหารชุดควบคุม สูตรที่ 2 ประกอบด้วยอาหารชุดควบคุมผสม C. irritans ระยะ theront เชื้อตาย สูตรที่ 3 ประกอบด้วยอาหารปลาชุดควบคุมผสมยีตส์ P. jadinii สูตรที่ 4 ประกอบด้วยอาหารชุดควบคุมผสม Sodium alginate อาหารทุกสูตรมีปริมาณโปรตีน 37-51 เปอร์เซ็นต์ และปริมาณไขมัน 16-19 เปอร์เซ็นต์ โดยแบ่งการทดลองเป็น 2 ครั้ง ครั้งที่ 1 ปลาการ์ตูนส้มขาวน้ำหนักเริ่มต้นเฉลี่ย 1.18 ± 0.22 กรัมและความยาวเฉลี่ย 3.79 ± 0.27 เซนติเมตร ให้ปลากินอาหาร 3 เปอร์เซ็นต์ของน้ำหนักตัวตลอดการทดลอง 4 สัปดาห์ โดยให้ปลากินอาหารทดลองแต่ละสูตรเป็นเวลา 2 สัปดาห์แรกของการทดลองหลังจากนั้นเปลี่ยนให้ปลาทุกชุดการทดลองกินอาหารชุดควบคุมต่อไปอีกเป็นเวลา 2 สัปดาห์ เมื่อสิ้นสุดการทดลอง นำปลาการ์ตูนจำนวน 30 ตัว/ซ้ำ ไปเผชิญเชื้อ C. irritans ระยะ theront จำนวน 1,500 เซลล์/ปลา 1 ตัว พบว่าพบว่าปลาที่กินอาหารสูตร 2 มีอัตราการรอดสูงสุด 100% รองลงมาได้แก่ปลากินอาหารสูตร 3 และ 4 มีอัตราการรอด 97% ทั้งสองชุด ส่วนปลาชุดควบคุม มีอัตราการรอดที่ 93% และเมื่อนำมาหาค่าอัตราการรอดตายสัมพัทธ์ (RPS) พบว่า ปลาปลาที่กินอาหารสูตร 2 และ 3 มีค่า RPS สูงถึง 100 และ 57 ตามลำดับ การทดลองครั้งที่ 2 ปลาการ์ตูนมีน้ำหนักเฉลี่ย 0.97 ± 0.11 ก. และขนาดเฉลี่ย 3.38 ± 0.14 ซม. ให้กินอาหาร 4 สูตรเดิม โดยให้กินอาหารสูตรทดลอง 1 สัปดาห์ สลับกับอาหารสูตร 1 ต่ออีก 1 สัปดาห์ จนครบ 8 สัปดาห์ ที่ปริมาณ 3% ของน้ำหนักเฉลี่ย นำปลาแต่ละชุดการทดลองมาจำนวน 30 ตัว/ซ้ำ ให้เผชิญเชื้อ C. irritans ระยะ theront จำนวน 1,500 theronts/ปลา 1 ตัว เป็นเวลา 3 สัปดาห์ พบว่าอัตราการรอดตายของปลาการ์ตูนชุดการทดลองที่ 1, 2, 3 และ 4 คือ 28.89%, 55.56%, 23.33% and 68.89% ตามลำดับ ค่า RPS ของชุดการทดลองที่ 2 มีค่า 38 ในระหว่างการทดลอง ทำเก็บตัวอย่างเลือดปลาเมื่อครบสัปดาห์ที่เพื่อตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงของระบบภูมิคุ้มกันเบื้องต้นในซีรั่ม สำหรับการทดลองในปลาการ์ตูนครั้งที่ 1 พบว่าค่าแอนติบอดีในซีรั่มปลาการ์ตูนชุดการทดลองที่ 2 และ 3 มีค่าสูงสุดที่สัปดาห์ที่ 5 และ 6 ตามลำดับ การเปลี่ยนแปลงปริมาณโปรตีนในซีรั่มปลาพบว่าชุดการทดลองที่ 2 มีค่าโปรตีนสูงสุดที่ ที่สัปดาห์ที่ 6 และในการทดลองกับปลาการ์ตูนครั้งที่ 2 ไม่พบค่าการเปลี่ยนแปลงของระดับ antibody titers และระดับของโปรตีนในซีรั่มปลาทั้ง 4 ชุดการทดลองอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ	th_TH
dc.description.sponsorship	โครงการวิจัยประเภทงบประมาณเงินรายได้จากเงินอุดหนุนรัฐบาล (งบประมาณแผ่นดิน) ประจำปีงบประมาณ พ.ศ. 2558	en
dc.language.iso	th	th_TH
dc.publisher	สถาบันวิทยาศาสตร์ทางทะเล มหาวิทยาลัยบูรพา	th_TH
dc.subject	ปรสิตสัตว์น้ำ	th_TH
dc.subject	วัคซีน	th_TH
dc.subject	สาขาเกษตรศาสตร์และชีววิทยา	th_TH
dc.subject	แบคทีเรีย	th_TH
dc.title	การพัฒนาการผลิตวัคซีนและสารเสริมอาหารโดยเทคนิคการตรึงเพื่อกระตุ้นภูมิคุ้มกันของปลาทะเลต่อปรสิตสัตว์น้ำหรือแบคทีเรีย	th_TH
dc.title.alternative	The development of vaccination and feed additive inclusion via encapsulation teachniques to stimuate the immune system of marine fish species infected with parasitic and bacterial pathhgens	en
dc.type	Research	th_TH
dc.author.email	supannee@buu.ac.th
dc.author.email	janjarus@buu.ac.th
dc.author.email	jarunan@buu.ac.th
dc.year	2559
dc.description.abstractalternative	The marine yeast Pichia sp. was cultured in a sugarcane bagass media adjusted to a salinity of 25 ppt. for a period of 96 h. Peak growth was observed at 72 h when the cell number reached 2.45 x 108 cells/ml. The fatty acid components of the immobilized yeast cells in calcium alginate beads were subsequently analysed. Palmitic acid represented the main component with a value of 21.20 ± 0.57%. Oleic and linoleic acids were also detected and found to represent 17.83 ± 0.35% and 3.14± 0.10% respectively. The total saturated and total monounsaturated fatty acid components of the dried yeast cells beads were 32.61% and 20.36% respectively. Effective immobilization of the Pichia sp. cells was achieved using a combination of 1.2% w/v sodium alginate and 1.5% w/v calcium chloride for the appropriate restriction of gross nutrients within the yeast cells. The present study set out follow changes in a number of selected immune parameters in Asian seabass, Lates calcarifer, that were fed a range of experimental diets and then subsequently challenged with the infective stages of the ciliate Cryptocaryon irritans. A 4 x 3, completely randomised design was used to investigate the responses of the fish fed the experimental diets. The four experimental diets were: 1) the control diet, i.e. a seabass basal feed; 2) inactivated theronts of C. irritans mixed with the same control diet that was used as diet 1; 3) a mixture of the control diet and the yeast Pichia sp.; and, 4) a mixture of the control diet and sodium alginate. All the experimental diets contained between 49-51% protein and 12-13% lipid. The initial weight and length of the fish were 6.21 ± 0.79 g and 8.15 ± 0.58 cm respectively. Throughout the 4-week long feeding trial, the fish were fed at 3% body weight day-1. Each group of fish were fed on their relevant experimental diet for two weeks and then were switched onto the control diet for a further two weeks. At the end of the feeding period, 30 fish from each treatment group were taken and challenged with live theronts of C. irritans at a dose of 15,000 theronts fish-1. Eighty-three percent of the fish fed diets 1 and 2 survived the challenge, while 93% and 90% of those fed diets 3 and 4 respectively survived. During the trial, blood samples were taken at key time points from each group of fish to monitor lysozyme activity; samples were taken at the start and end of the feeding period with the experimental diets and then on days 3, 7 and 14 post-challenge. The highest levels of lysozyme activity were seen by the end of the fourth week on the experimental diets, with the fish in the groups fed diets 2 and 3 having higher levels of lysozyme than those fed the control diet. An ELISA confirmed that the levels of serum antibody in the fish fed diets 2 and 3 for two weeks had increased and were better than those fish fed on diets 1 and 4. By the end of the feeding period at the end of week 4, the fish fed diets 2 and 3 had similar levels of serum antibody. Serum protein was found to increase throughout the trial in those groups of fish fed on diets 2, 3 and 4, which had higher levels than those fed the control diet. The level of serum antibody in the groups of fish fed diets 1-3, increased after the fish were challenged with C. irritans, while the levels of serum antibody in the fish given diet 4 remained unchanged throughout the trial. Seven days after the fish were challenged with the parasite, trophonts could be seen on the bodies of the fish and the levels of antibody serum rose while the levels of protein serum fell in all the experimental fish. The fish fed the diet containing the inactivated theronts of C. irritans, however, had higher levels of protein serum than those fed the control diet indicating that the inactivated theronts and the Pichia sp. were able to stimulate the L. calcarifer to respond to the antigens of the parasite by increasing their levels of antibody. Finally, this study set out follow changes in a number of selected immune parameters in clownfish, Amphiprion ocellaris, that were fed a range of experimental diets and then subsequently challenged with the infective stages of the ciliate Cryptocaryon irritans. A 4 x 3, completely randomised design was used to investigate the responses of the fish fed the experimental diets. The four experimental diets were: 1) the control diet, i.e. an ornamental basal feed; 2) inactivated theronts of C. irritans mixed with the same control diet that was used as diet 1; 3) a mixture of the control diet and the yeast Pichia sp.; and, 4) a mixture of the control diet and sodium alginate. All the experimental diets contained between 37-51% protein and 16-19% lipid. Based on the first experiment, the initial weight and length of the fish were 1.18 ± 0.22 g and 3.79 ± 0.27 cm respectively. Throughout the 4-week long feeding trial, the fish were fed at 3% body weight day-1. Each group of fish were fed on their relevant experimental diet for two weeks and then were switched onto the control diet for a further two weeks. At the end of the feeding period, 30 fish from each treatment group were taken and challenged with live theronts of C. irritans at a dose of 1,500 theronts fish-1 for 2 weeks. The survival rate of each group were 93%, 100%, 97% and 97%, respectively. These results showed no significantly difference in survival rate. The RPS of treatment 2 and 3 were 100 and 57, respectively. The second experiment, the initial weight and length of the fish were 0.97 ± 0.11 g and 3.38 ± 0.14 cm respectively. The same diet is used in this experiment. Each group were fed on their experiment diet for one week then were swithched onto control diet for one week until 8 weeks. Then, 30 fish from each treatment group were taken and challenged with live theronts of C. irritans at a dose of 1,500 theronts fish-1 for 3 weeks. The survival rate of each group were 28.89%, 55.56%, 23.33% and 68.89%, respectively. The RPS of fish fed diet 2 was 38. During the trial, blood samples were taken at key time points from each group of clownfish to monitor an antibody titers by ELISA technique. In the first experiment, the antibody titers significantly increased when fish were fed with diet 2 and 3 at week 5 and 6, respectively. The highest protein serum were detected in clownfish fed with diet 2 at week 6. In the second experiment, the results showed no significant difference in antibody titers and protein serum during the experimental period	en