การพัฒนาการผลิตวัคซีนและสารเสริมอาหารโดยเทคนิคการตรึงเพื่อกระตุ้นภูมิคุ้มกันของปลาทะเลต่อปรสิตสัตว์น้ำหรือแบคทีเรีย

Abstract

จากการศึกษาการเลี้ยงยีสต์ P. jadinii ในอาหารเลี้ยงเชื้อกากชานอ้อยที่ความเค็ม 25 พีพีที เป็นเวลา 96 ชั่วโมง มีการเจริญสูงสุดในระยะเวลาการเลี้ยงที่ 72 ชั่วโมง และมีจำนวนเซลล์เท่ากับ 2.45 x 108 เซลล์ต่อมิลลิลิตร จากการวิเคราะห์ชนิดและปริมาณกรดไขมันจากเม็ดเจลที่ตรึงยีสต์ Pichia sp. ด้วยแคลเซียมอัลจิเนต พบกรดปาล์มิติกเป็นองค์ประกอบหลักมากที่สุดร้อยละ 21.20 ± 0.57 กรดโอเลอิกและกรดไลโนเลอิกร้อยละ 17.83 ± 0.35 และ 3.14 ± 0.10 ตามลำดับ ในขณะที่พบกรดไขมันอิ่มตัวและกรดไขมันไม่อิ่มตัวเชิงเดี่ยวทั้งหมดในเม็ดเจลแห้งร้อยละ 32.16 และ 20.36 ตามลำดับ หลังจากนั้นนำ P. jadinii และปรสิต Cryptocaryon irritans ที่เก็บรวบรวมได้ปริมาณมากนำมาทดสอบชนิดของวัสดุและวิธีการตรึงเซลล์ เพื่อไม่ให้ละลายออกมาในน้ำ พบว่าสามารถตรึงตัวอย่างได้ด้วย โซเดียมอัลจิเนตเข้มข้นร้อยละ 1.2 และแคลเซียมคลอไรด์ร้อยละ 1.5 ต่อมานำอาหารที่ผลิตได้มาทดสอบต่อการเปลี่ยนแปลงระบบภูมิคุ้มกันเบื้องต้นของปลากะพงขาว (Lates calcarifer) ที่ให้กินอาหารทดลองหลายสูตรต่อการต้านทานปรสิตชนิด C. irritans โดยวางแผนการทดลองแบบสุ่มตลอด (4x3 Completely Randomised Design) อาหารทดลองประกอบด้วยอาหารเม็ดชนิดจมน้ำ 4 สูตร อาหารสูตรที่ 1 อาหารชุดควบคุมประกอบด้วยสูตรอาหารปลากะพง สูตรที่ 2 ประกอบด้วยอาหารชุดควบคุมผสม C. irritans ระยะ theront เชื้อตาย สูตรที่ 3 ประกอบด้วยอาหารปลาชุดควบคุมผสมยีตส์ P. jadinii สูตรที่ 4 ประกอบด้วยอาหารชุดควบคุมผสม Sodium alginate อาหารทุกสูตรมีปริมาณโปรตีน 49-51 เปอร์เซ็นต์ และปริมาณไขมัน 12-13 เปอร์เซ็นต์ ทำการทดลองในปลากะพงขาวน้ำหนักเริ่มต้นเฉลี่ย 6.21 ± 0.79 กรัมและความยาวเฉลี่ย 8.15 ± 0.58 เซนติเมตร ให้ปลากินอาหาร 3 เปอร์เซ็นต์ของน้ำหนักตัวตลอดการทดลอง 4 สัปดาห์ โดยให้ปลากินอาหารทดลองแต่ละสูตรเป็นเวลา 2 สัปดาห์แรกของการทดลองหลังจากนั้นเปลี่ยนให้ปลาทุกชุดการทดลองกินอาหารชุดควบคุมต่อไปอีกเป็นเวลา 2 สัปดาห์ เมื่อสิ้นสุดการทดลอง นำปลากะพงขาวจำนวน 30 ตัวต่อชุดการทดลองไปเผชิญเชื้อ C. irritans ระยะ theront จำนวน 15,000 เซลล์/ปลา 1 ตัว พบว่าปลาที่กินอาหารสูตรที่ 1 และ 2 มีอัตราการรอดตายร้อยละ 83 และปลาที่กินอาหารสูตร 3 และ 4 มีอัตราการรอดตายร้อยละ 93 และ 90 ตามลำดับ เมื่อนำมาวิเคราะห์หาค่าเปอร์เซนต์รอดตายสัมพัทธ์ (RPS) พบว่าปลากะพงขาวที่กินอาหารสูตร 3 มีค่า RPS สูงสุดที่ 59 ในระหว่างการทดลองทำเก็บตัวอย่างเลือดปลาเริ่มต้นการทดลอง ตัวอย่างเลือดปลากินอาหารทดลองเป็นระยะเวลา 2 สัปดาห์ ตัวอย่างเลือดปลาที่กินอาหารชุดควบคุมหลังจากกินอาหารทดลอง 2 สัปดาห์ และตัวอย่างเลือดปลาหลังจากเผชิญเชื้อเป็นระยะเวลา 3 7 และ 14 วัน เพื่อทำการตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงของระบบภูมิคุ้มกันเบื้องต้น ได้แก่ กิจกรรมไลโซไซม์ในซีรั่ม ปลาที่กินอาหารสูตรที่ 2 และ 3 ที่มีปรสิตและยีสต์เป็นองค์ประกอบมีปริมาณไลโซไซม์สูงกว่าปลากินอาหารชุดควบคุม และมีปริมาณไลโซไซม์ในซีรั่มสูงสุดในสัปดาห์ที่ 4 ของการทดลอง เมื่อตรวจวัดระดับแอนติบอดีในซีรั่มปลากะพงขาวโดยเทคนิค ELISA พบว่าปลาที่กินอาหารที่มีปรสิตและยีสต์เป็นองค์ประกอบเป็นเวลา 2 สัปดาห์ มีแนวโน้มของระดับของแอนติบอดีสูงกว่าปลาที่กินอาหารชุดควบคุมและอาหารที่มีโซเดียมอัลจิเนตเป็นองค์ประกอบ โดยที่ระดับแอนติบอดีในซีรั่มปลาที่ได้รับการกระตุ้นด้วยปรสิตและยีสต์มีค่าใกล้เคียงกันเมื่อสิ้นสุดการทดลองที่ 4 สัปดาห์ ส่วนปริมาณโปรตีนในซีรั่มปลากะพงพบว่าเพิ่มขึ้นเมื่อระยะเวลาการเลี้ยงนานขึ้น โดยเฉพาะปลาที่กินอาหารสูตรที่ 2 3 และ 4 และเมื่อให้ปลาเผชิญเชื้อแล้วเป็นเวลา 3 7 และ 14 วัน พบว่าแนวโน้มของระดับแอนติบอดีของปลาที่กินอาหารสูตรที่ 1 2 และ 3 สูงขึ้น ส่วนระดับแอนติบอดีของปลาที่กินอาหารสูตรที่ 4 ค่อนข้างคงที่ตลอดการทดลอง แต่เมื่อปรากฏจุดขาวขึ้นที่ตัวปลาหลังจากเผชิญเชื้อแล้ว 7 วัน ระดับแอนติบอดีของปลาสูงขึ้นในทุกชุดการทดลองซึ่งตรงกันข้ามกับปริมาณโปรตีนในซีรั่มที่มีแนวโน้มลดลง อย่างไรก็ตามปลาที่เลี้ยงด้วยอาหารสูตรที่มี C. irritans ระยะ theront เชื้อตายเป็นส่วนผสมมีปริมาณโปรตีนในซีรั่มสูงกว่าในปลาที่เลี้ยงด้วยอาหารชุดควบคุม ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าปรสิต C. irritans ระยะ theront เชื้อตาย และยีสต์ P. jadinii สามารถกระตุ้นให้ปลาตอบสนองต่อแอนติเจนโดยสร้างแอนติบอดีเพิ่มขึ้น การทดลองศึกษาการเปลี่ยนแปลงระบบภูมิคุ้มกันเบื้องต้นของปลาการ์ตูนส้มขาว (Amphiprion ocellaris) ที่ให้กินอาหารทดลอง 4 สูตรต่อการต้านทานปรสิตชนิด Cryptocaryon irritans โดยวางแผนการทดลองแบบสุ่มตลอดเช่นเดียวกับปลากะพงขาว อาหารทดลองประกอบด้วยอาหารเม็ดชนิดจมน้ำ 4 สูตร อาหารสูตรที่ 1 อาหารชุดควบคุม สูตรที่ 2 ประกอบด้วยอาหารชุดควบคุมผสม C. irritans ระยะ theront เชื้อตาย สูตรที่ 3 ประกอบด้วยอาหารปลาชุดควบคุมผสมยีตส์ P. jadinii สูตรที่ 4 ประกอบด้วยอาหารชุดควบคุมผสม Sodium alginate อาหารทุกสูตรมีปริมาณโปรตีน 37-51 เปอร์เซ็นต์ และปริมาณไขมัน 16-19 เปอร์เซ็นต์ โดยแบ่งการทดลองเป็น 2 ครั้ง ครั้งที่ 1 ปลาการ์ตูนส้มขาวน้ำหนักเริ่มต้นเฉลี่ย 1.18 ± 0.22 กรัมและความยาวเฉลี่ย 3.79 ± 0.27 เซนติเมตร ให้ปลากินอาหาร 3 เปอร์เซ็นต์ของน้ำหนักตัวตลอดการทดลอง 4 สัปดาห์ โดยให้ปลากินอาหารทดลองแต่ละสูตรเป็นเวลา 2 สัปดาห์แรกของการทดลองหลังจากนั้นเปลี่ยนให้ปลาทุกชุดการทดลองกินอาหารชุดควบคุมต่อไปอีกเป็นเวลา 2 สัปดาห์ เมื่อสิ้นสุดการทดลอง นำปลาการ์ตูนจำนวน 30 ตัว/ซ้ำ ไปเผชิญเชื้อ C. irritans ระยะ theront จำนวน 1,500 เซลล์/ปลา 1 ตัว พบว่าพบว่าปลาที่กินอาหารสูตร 2 มีอัตราการรอดสูงสุด 100% รองลงมาได้แก่ปลากินอาหารสูตร 3 และ 4 มีอัตราการรอด 97% ทั้งสองชุด ส่วนปลาชุดควบคุม มีอัตราการรอดที่ 93% และเมื่อนำมาหาค่าอัตราการรอดตายสัมพัทธ์ (RPS) พบว่า ปลาปลาที่กินอาหารสูตร 2 และ 3 มีค่า RPS สูงถึง 100 และ 57 ตามลำดับ การทดลองครั้งที่ 2 ปลาการ์ตูนมีน้ำหนักเฉลี่ย 0.97 ± 0.11 ก. และขนาดเฉลี่ย 3.38 ± 0.14 ซม. ให้กินอาหาร 4 สูตรเดิม โดยให้กินอาหารสูตรทดลอง 1 สัปดาห์ สลับกับอาหารสูตร 1 ต่ออีก 1 สัปดาห์ จนครบ 8 สัปดาห์ ที่ปริมาณ 3% ของน้ำหนักเฉลี่ย นำปลาแต่ละชุดการทดลองมาจำนวน 30 ตัว/ซ้ำ ให้เผชิญเชื้อ C. irritans ระยะ theront จำนวน 1,500 theronts/ปลา 1 ตัว เป็นเวลา 3 สัปดาห์ พบว่าอัตราการรอดตายของปลาการ์ตูนชุดการทดลองที่ 1, 2, 3 และ 4 คือ 28.89%, 55.56%, 23.33% and 68.89% ตามลำดับ ค่า RPS ของชุดการทดลองที่ 2 มีค่า 38 ในระหว่างการทดลอง ทำเก็บตัวอย่างเลือดปลาเมื่อครบสัปดาห์ที่เพื่อตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงของระบบภูมิคุ้มกันเบื้องต้นในซีรั่ม สำหรับการทดลองในปลาการ์ตูนครั้งที่ 1 พบว่าค่าแอนติบอดีในซีรั่มปลาการ์ตูนชุดการทดลองที่ 2 และ 3 มีค่าสูงสุดที่สัปดาห์ที่ 5 และ 6 ตามลำดับ การเปลี่ยนแปลงปริมาณโปรตีนในซีรั่มปลาพบว่าชุดการทดลองที่ 2 มีค่าโปรตีนสูงสุดที่ ที่สัปดาห์ที่ 6 และในการทดลองกับปลาการ์ตูนครั้งที่ 2 ไม่พบค่าการเปลี่ยนแปลงของระดับ antibody titers และระดับของโปรตีนในซีรั่มปลาทั้ง 4 ชุดการทดลองอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ