การจำแนกชนิดของม้าน้ำสกุล Hippocampus ด้วยข้อมูลทางพันธุกรรมจากเครื่องหมายดีเอ็นเอ

Abstract

แบบแผนอาร์เอพีดี (RAPD patterns) ที่ได้จากการเพิ่มขยายโดยปฏิกิริยาอารืเอพีดี และอาศัยการตรวจสอบแถบดีเอ็นเอที่ปรากฏร่วมกันของตัวอย่างภายในสปีชีส์เดียวกัน และปริมาณความเข้มของแถบดีเอ็นเอที่ปรากฏ จากการตรวจสอบไพรเมอร์ จำนวน 53 ไพรเมอร์ พบว่า ไพรเมอร์ส่วนใหญ่ให้แบบแผนอาร์เอพีดีที่จำเพาะกับสปีชีร์ และสามารถนำมาใช้ในการจำแนกสปีชีร์ของม้าน้ำ 3 สปีชีร์ ในสกุล Hippocampus คือ ม้าน้ำดำ (H. kuda) ม้าน้ำหนาม (H. spinosissimus) และ ม้าน้ำสามจุด (H.trimaculatus) ได้ มีเพียงบางไพรเมอร์ที่ให้ผลไม่เด่นชัด และจากข้อมูลของแถบดีเอ็นเอที่ตรวจสอบได้ของแต่ละไพเมอร์ที่ให้แถบดีเอ็นเอที่จำเพาะต่อสปีชีร์ ก็สามารถนำมาประยุกต์ใช้ในการสร้างเครื่องหมายทางพันธุกรรมที่จำเพาะต่อสปีชีร์โดยอาศัยการตรวจสอบโดยเทคนิคพีซีอาร์ รวมทั้งการนำข้อมูลของแถบเอ็นแอที่ได้มาเป็นข้อมูลพื้นฐานเพื่อการศึกษาลักษณะโครงสร้างทางพันธุกรรม และการเพาะเลี้ยงของม้าน้ำต่อไปได้ และสำหรับการตรวจสอบแบบแผนอาร์เอฟแอลพี การศึกษานี้ได้ทำการเพิ่มขยายชิ้นดีเอ็นเอที่ตำแหน่งยีน 12S และ 16S rRNA ของดีเอ็นเอที่ได้จากเนื้อเยื่อในส่วนกล้ามเนื้อม้าน้ำดำ (H. kuda) และม้าน้ำหนาม (H. spinosissimus) โดยปฏิกิริยาพีซีอาร์ด้วยไพรเมอร์ 3 คู่ คือ L1091 กับ H1478 และ L1091 กับ H 2001 ที่จำเพาะกับตำแหน่งยีน 12S rRNA และคู่ไพรเมอร์ L2510 กับ H3508 ที่จำเพาะกับตำแหน่งยีน 16S rRNA ก่อนนำผลผลิตพีซีอาร์ส่งไปตรวจสอบลำดับเบส แล้วนำลำดับเบสที่ได้มาวิเคราะห์กับฐานข้อมูล GeneBank บนเครือข่ายอินเทอร์เน็ต เพื่อนำข้อมูลลำดับเบสของตัวอย่างม้าน้ำในสกุลเดียวกันที่มีความเหมือน มา alignment ก่อนวิเคราะห์ตำแหน่งตัดของเอนไซม์ตัดจำเพาะกับผลผลิตพีซีอาร์ เพื่อให้ได้แบบแผนอาร์เอฟแอลพีซึ่งให้ผลการตัดที่สามารถจำแนกสปีชีร์ได้ เมื่อยืนยันผลการวิเคราะห์โดยเทคนิคพีซีอาร์-อาร์เอฟแอลพี ด้วยเอนไซม์บางชนิด ได้แก่ Spel, NlaIII และ Dral กับผลผลิตพีซีอาร์ที่ได้จากปฏิกิริยาพีซีอาร์โดยคู่ไพรเมอร์ทั้งสามข้างต้น สามารถแสดงให้เห็นถึงการจำแนกสปีชีร์ของม้าน้ำดำกับม้าน้ำหนามออกจากกันได้ The common bands of each sample within species and density of each common band of RAPD amplification were examined for the RAPD patterns. The result show that most of primer of 53 RAPD primers have species-specific patterns that can be used to identify three species of seahorse (Genbus Hippocampus) such as spotted seahorse (Hippocampus kuda), hedgehog seahorse (H. spinosissimus) and three-spot seahorse (H. trimaculatus), only a few primers wea not clear. The species-specific bands of each primer can be applied to develop PCR technique for species-specific marker. Furthermore, this data can use as database for research of genetic structure, molecular level of seahorse, seahorse fisheries management and also seahorse aquaculture. For RFLP patterns, the amplification of the mitochondrial 12S and 16S rRNA with a template of total DNA from muscle tissues of spotted seahorse (Hippocampus kuda) and hedgehog seahorse (H. spinosissimus) was studied. Three pairs of primers, L1091, H1478 and L1091, H2001 that specific with 12S rRNA and couple of L2510 and H3058 that specific with 16S rRNA were used in PCR reaction. The base sequencing of PCR production was sequenced by BSU (Bioservice Unit). Then nucleotide sequences encoding a partial region of the 12S and 16S rRNA gene of two species were compared with other species in GeneBank database net work. The sequenced fragments were also used to select restriction enzymes, yielding species specific restriction fragment length polymorphisms (RFLP). After calculation of corresponding RFLP-patterns of two species and other species investigated with suitable restriction enzymes, the selected restriction enzymes: Spel, N del, NlaIII และ Dral; were found to be sufficient for identification of two species of seahorse.