การค้นหาเครื่องหมายพันธุกรรมชนิด cDNA-AFLP ที่เกี่ยวข้องกับการเจริญเติบโตของกุ้งกุลาดำ Penaeus monodon ในบ่อดิน

Abstract

งานวิจัยนี้เป็นการค้นหาเครื่องหมายพันธุกรรมชนิด cDNA-AFLP ที่เกี่ยวข้องกับการเจริญเติบโตของกุ้งกุลาดำ Penaeus monodon ในบ่อดิน ของกุ้งกุลาดำ 2 กลุ่ม (PM03 และ PM05) โดยเลือกตัวอย่างจากน้ำหนักตัวของกุ้งกุลาดำ 2 กลุ่ม คือ น้ำหนักมากจำนวน 6 ตัว (น้ำหนักเฉลี่ย 17.57 ± 1.8 และ 40.97 ± 4.0 และน้ำหนักน้อยจำนวน 6 ตัว (น้ำหนักเฉลี่ย 10.01 ± 0.76 and 22.86 ± 2.51) ของตัวอย่างกุ้งกุลาดำทั้งหมด 342 และ 356 ตัวต่อกลุ่มตามลำดับ จาการตรวจสอบผลการทดสอบจากการทำ cDNA-AFLP ด้วยไพรเมอร์ พบว่ามี 63 คู่ไพรเมอร์ที่ให้ผล cDNA-AFLP และพบเครื่องหมาย cDNA-AFLP จำนวน 50 เครื่องหมาย จาก 22 คู่ไพรเมอร์ที่ให้ผลแถบของเครื่องหมาย cDNA-AFLP ที่มีความจำเพาะ/แตกต่างกันระหว่างกลุ่มตัวอย่าง ทำการคัดเลือกเครื่องหมายจาก cDNA-AFLP fragments ที่พบในกลุ่มน้ำหนักน้อยจำนวน 1 เครื่องหมาย พบในกลุ่มน้ำหนักจำนวน 1 เครื่องหมายพบในน้ำหนักน้อยมากกว่าจำนวน 2 เครื่องหมาย พบในน้ำหนักมากกว่าในน้ำหนักน้อย จำนวน 2 เครืองหมาย พบทั้งในน้ำหนักน้อยและมากจำนวนมาก 2 เครื่องหมาย พบในกลุ่ม PM03 มากกว่า PM05 จำนวน 2 เครื่องหมาย และพบในกลุ่ม PM05 มากกว่า PM03 จำนวน 2 เครื่องหมาย เพื่อทำการโคลนและหาลำดับนิวคลีโอไทด์ โดยสามารถหาลำดับนิวคลีโอไทด์ได้ 10 เครื่องหมาย ผลการเปรียบเทียบ ลำดับนิวคลีโอไทด์ของเครื่องหมาย cDNA-AFLP กับ ฐานข้อมูลใน GenBank พบว่าลำดับคลีโอไทด์จากชิ้น cDNA-AFLP จำนวน 6 เครื่องหมายให้ผลไม่เหมือนกับฐานข้อมูลลำดับนิวคลีโอไทด์ใดๆ ในห้องสมุดยีน (unknow, E-value <10-4) ส่วนลำดับนิวคลีโอไทค์จากชิ้น cDNA-AFLP จำนวน 4 เครื่องหมาย คล้ายกับ Inositol oxygenase ใน Anoplopoma fimbria mค่า E-value เป็น 6e^(-08) (E_(+3)1M_(+3)8-480) Hypothetical protein YQE02849, partial ใน Dendroctonus porderosae ที่ค่า E-value เป็น 1e^(-51) (E_(+3)4M_(+3)14-420) protein disulfide-ismerase domain protein .o Necator americanus ที่ค่า E-value เป็น 5e^(-27) (E_(+3)4M_(+3)14-550) และ Hemocyanin (Hemo gene) .o Litopenaues vannamei ที่ค่า E-value เป็น 1e^(-28) (E_(+2)4M_(+2)3-390) ตามลำดับ จากการศึกษารูปแบบการแสดงออกของเครื่องหมาย SCAR/cDNA-AFLP ด้วยวิธี SSCP-PCR ด้วย ไพรเมอร์ PP-E_(+3)4M_(+3)14-550-PDI และ PP-E_(+3)5M_(+3)10-350-Unk ให้รูปแบบ SSCP เป็น SSCP เป็น monomorphism ส่วนไพรเมอร์ PP-E_(+3)1M_(+3)8-480-InositolOxy และ PP-E_(+3)6M_(+3)15-460-Unk ให้รูปแบบ SSCP เป็น polymorphism ซึ่งรูปแบบ polymorphism ที่ได้ไม่มีความสัมพันธ์ต่อกุ้งกุลาดำกลุ่ม ใดกลุ่มหนึ่ง จากการศึกษารูปแบบการแสดงออกของเครื่องหมาย SCAR/cDNA-AFLP ด้วยวิธี quantitive real-time PCR ในตับอ่อนของกุ้งกุลาดำกลุ่มน้ำหนักมากและกุ้งกุลาดำกลุ่มน้ำหนักน้อย ด้วยไพรเมอร์ PP-E_(+3)4M_(+3)14-550-PDI พบว่า PP-E_(+3)4M_(+3)14-550-PDI และ PP-E_(+3)5M_(+3)10-350-Unk มีระดับการแสดงออกในกุ้งกุลาดำกลุ้มน้ำหนักมากมากกว่ากลุ่มน้ำหนักน้อย อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (P<0.05) ส่วนไพรเมอร์ SCAR/cDNA-AFLP PP-E_(+3)1M_(+3)8-480-InositolOxy มีระดับการแสดงออกในกุ้งกุลาดำกลุ่มน้อย มากว่ากุ้งกุลาดำกลุ่มน้ำหนักมากอย่างมัยสำคัญทางสถิติ (P<0.05) ผลจากงานวิจัยนี้แสดงให้เห็นว่าสามารถใช้เทคนิค cDNA-AFLP ในการค้นหาเครื่องหมายพันธุ์กรรมที่สัมพันธ์กับการเจริญเติบโตของกุ้งกุลาดำ Penaeus monodon ได้ โดยเครื่องหมายดังกล่าวสามารถใช้มนการเป็นข้อมูลประกอบการสร้างแผนที่ยีน (genetic linkage map) เพ่อหาความสำพันธ์ของลักษณะเชิงปริมาณ (QTL) ที่เกี่ยวของกับการเจริญเติบโต ซึ่งมีประโยชน์อย่างยิ่งต่อการสร้างโปรแกรมการคัดพันธุ์สัตว์เศรษฐกิจชนิดนี้ Genes exhibiting differential expression patterns between large-sized (average body weight17.57 ± 1.8 and 40.97 ± 4.0 for 3- and 5-month-old juveniles in a total of 342 and 356 ) and small-sized (average body weight 10.01 ± 0.76 and 22.86 ± 2.51, respectivety) group of juveniles giant tiger shrimp (Penaeus monodon) were isolated by complementary DNA-amplified fragment length polymorphism (cDNA-AFLP). In total, 368 primer combinations were screened against the first strand cDNA of 3- and 5-month-old P. monodon. Sixty three ptimer combinations generated the amplification products and 50 cDNA-AFLP fragment from 22 primer combinations displaying specific/differential/comparable expression patterns were found. Of these, 1 fragment only expessed in small-sized shrimp, 1 fragment only expressed in large-sized shrimp fragment exhibited a greater expression in small-sized group, 2 fragments expressed more abundantly in the opposite direction, 2 fragments comparably expressed among group, 2fragment differentially expressed toward 3-mounth-old shrimp and 2 fragments differentially expressed towards 5-month-old shrimp were selected, cloned and sequenced. Ten fragments were successfully cloned and sequenced. Nucleotide sequences of 6 cDNA-AFLP fragments did not match any sequence in GenBank (E-value > 1e-04). However, four sequences significant matched Inositol oxygenase (Anoplopoma fimbria, with E-value = 6e^(-08) ,E_(+3)1M_(+3)8-480) Hypothetical protein YQE02849 (Dendroctonus porderosae with E-value = 1e^(-51) ,E_(+3)4M_(+3)14-420), protein disulfide-isomerase domain protein (Necator americanus with E-value = 5e^(-27) ,E_(+3)4M_(+3)14-550) and Hemocyanin (Litopenaues vannamei with E-value = 1e^(-28) , E_(+2)4M_(+2)3-390). Single strand conformational polymorphism (SSCP) analysis using SCAR/cDAN-AFLP primers were examined. PP-E_(+3)4M_(+3)14-550-PDI and PP-E_(+3)5M_(+3)10-350-Unk showed monomorphism while PP-E_(+3)1M_(+3)8-480-InositolOxy and PP-E_(+3)6M_(+3)15-460-Unk showed polymorphism patterns. However, the derived polymorphism did not showed the correlation to the body weight of P. monodon. Quantitative real*time PCR using SCAR/cDNA-AFLP primers were also examined. Interestingly, the relative expression levels of PP-E_(+3)4M_(+3)14-550-PDI and PP-E_(+3)5M_(+3)10-350-Unk in hepatopancreas of juvenile shrimp was significantly up-regulated in large-sized. Whereas, the relative expression levels of PP-E_(+3)1M_(+3)8-480-InositolOxy was significantly up-regulated in small-sized. Results in the present study indicated that cDNA-AFLP is potential for isolation of functionally important transcripts in P. monodon. The derived markers can be applied to construct the genetic linkage map for QTL in this economically important specis.