โครงการการศึกษาลักษณะเบื้องต้นของโปรตีนชั้นผิวพยาธิใบไม้ตับ Fasciola gigantica ที่มีศักยภาพสูงสำหรับการพัฒนาการวินิจฉัยโรคพยาธิ fasciolosis

วิทูร ขาวสุข

dc.contributor.author	วิทูร ขาวสุข
dc.contributor.other	มหาวิทยาลัยบูรพา. คณะสหเวชศาสตร์
dc.date.accessioned	2019-03-25T08:53:08Z
dc.date.available	2019-03-25T08:53:08Z
dc.date.issued	2555
dc.identifier.uri	http://dspace.lib.buu.ac.th/xmlui/handle/1234567890/774
dc.description.abstract	พยาธิใบไม้ตับ Fasciola gigantica พบการระบาดในปศุสัตว์เขตร้อน ก่อให้เกิดโรค fasciolosis ปัจจุบันการวินิจฉัยการติดเชื้อทำได้โดยการตรวจหาไข่พยาธิในอุจจาระสัตว์ ซึ่งเป็นการตรวจหาพยาธิมนระยะตัวเต็มวัยเท่านั้น นักวิทยาศาสตร์จึงตรวจหา antigen ที่จำเพาะในซีรั่มของสัตว์ทดลอง เพื่อเป็นการตรวจวินิจฉัยตั้งแต่ในระยะแรกของการติดเชื้อ งานวิจัยในครั้งนี้จะเป็นการศึกษาลักษณะของ antigen ที่พยาธิหลั่งจากชั้นผิวของพยาธิระยะตัวอ่อนและระยะตัวเต็มวัย รวมทั้งศักยภาพที่จะนำไปวินิจฉัยการติดเชื้อพยาธิ โดยคัดเลือกโปรตีนของ tegumetnal antigen ที่ปล่อยเข้าสู่โฮสต์และกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันได้หลายวิธี western immunoblotting จากนั้นผลิต polyclonal antibody(PoAb) ที่ต้านต่อ antigen ดังกล่าว แล้วตรวจสอบความจำเพาะเจาะจงของ PoAbs ด้วยวิธี ELISA และ western immunoblotting จากนั้นนำ PoAbs ไปตรวจหาคุณลักษณะของ antigen ด้วย 1 และ 2 dimension gel electrophoresis นอกจากนั้นตรวจลักษณะ glycosylation โดยย้อมด้วยสี periodic acid Shciff (PAS) ตรวจผล cross reaction ของ antibody ในพยาธิต่างๆ ตรวจหาตำแหน่งของ antigen ภายในเนื้อเยื่อด้วยวิธี immunoperoxidase นอกจากนี้ตรวจหาลำดับกรดอะมิโนของโปรตีนที่สนใจด้วยวิธี Tandem Mass spectrometry และนำ polyclonal antibody ไปทดสอบความสามารถในการตรวจวินิจฉัยการติดเชื้อพยาธิเบื้องต้นด้วยวิธี direct ELISA ผลการศึกษาพบว่ามีแถบโปรตีนที่น่าสนใจ 4 แถบ คือ 16 kDa 21 kDa และ 36 kDa และสามารถสร้าง PoAbs ที่ต้านต่อโปรตีนทั้ง 4 แถบได้ แต่ PoAbs ที่ต้านต่อ 16 kDa ให้ผล cross reaction กับโปรตีนหลายตัว จึงเป็นโปรตีนที่ไม่น่าสนใจ และ PoAbs ที่ต่านต่อ 25 kDa และ 36 kDa ให้ผลจำเพาะเจาะจง จากการศึกษาด้วยวิธี PAS พบว่าโปรตีนทั้ง 4 ชนิด ให้ผลบวก แสดงว่ามีหมู่น้ำตาลอยู่ภายในโมเลกุลของโปรตีน จากการศึกษา cross reaction พบว่า PoAb ที่ต้านต่อ 21 kDs ให้ผล cross reaction กับพยาธิ Paramphistomum sp. และ PoAbs ที่ต้านต่อ 25 kDa ให้ผล cross reaction กับ Eurytrema pancreaticum จากการศึกษาตำแหน่งของโปรตีนในเนื้อเยื่อที่พบว่า 21 kDa สามารถตรวจพบได้บริเวณชั้นผิวของพยาธิตัวอ่อนและตัวเต็มวัย ในขณะที่ 16 kDa 25 kDa และ 36 kDa ส่วนใหญ่ สามารถพบได้บริเวณเนื้อเยื่อ parenchyma แสดงให้เห็นว่า antigen ที่น่าสนใจมากที่สุดคือ 21 kDa จากการศึกษาด้วยวิธี 2-DE western immunoblotting พบว่า PoAb ที่ต้านต่อ 21 kDa สามารถทำปฏิกิริยากับ antigen 2 จุด ซึ่งเมื่อนำไปตรวจหาลำดับกรดอะมิโน พบว่าโปรตีนทั้ง 2 จุด คิอ calcium binding protein และเมื่อนำ PoAb ที่ต้านต่อ 21 kDa ไปตรวจการติดเชื้อพยาธิในสัตว์ทดลอง พบว่า สามารถตรวจสอบการติดเชื้อได้ตั้งแต่สัปดาห์ที่3 ของการติดเชื้อ จากผลการทดลองแสดงให้เห็นว่า TA เป็น antigen ที่สำคัญ สามารถหลั่งจากตัวพยาธิและกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันของโฮสต์ได้ดี จากการศึกษาในครั้งนี้สามารถสรุปได้ว่า 21 kDa หรือ calcium binding protein เป็น antigen ที่มีศักยภาพสูงสุดที่น่าจะสามารถนำไปศึกษาเพื่อพัฒนาการตรวจวินิจฉัยการติดเชื้อพยาธิ F.gigantica ในอนาคตได้	th_TH
dc.description.sponsorship	งานวิจัยในครั้งนี้ได้รับทุนสนับสนุนการวิจัยจาก สำนักบริหารงานโครงการวิจัยในอุดมศึกษาและพัฒนามหาวิทยาลัยวิจัยแห่งชาติ สำนักงานคณะกรรมการการอุดมศึกษา
dc.language.iso	th	th_TH
dc.publisher	คณะสหเวชศาสตร์ มหาวิทยาลัยบูรพา	th_TH
dc.subject	พยาธิใบไม้ตับ	th_TH
dc.subject	โรคพยาธิ	th_TH
dc.subject	สาขาวิทยาศาสตร์การแพทย์	th_TH
dc.title	โครงการการศึกษาลักษณะเบื้องต้นของโปรตีนชั้นผิวพยาธิใบไม้ตับ Fasciola gigantica ที่มีศักยภาพสูงสำหรับการพัฒนาการวินิจฉัยโรคพยาธิ fasciolosis	th_TH
dc.title.alternative	Study of the basic characteristics of the high potential Fasciola gigantica tegumetal antigens for the development of the fasciolosis diagnosis	en
dc.type	งานวิจัย
dc.year	2555
dc.description.abstractalternative	Fasciola gigantica is a causative parasite of fasciolosis in tropical country. The infection is leading to the huge economic loss worldwide. Diagnosis of the disease has done in the letter stage of infection by fecal egg count. In order to investigate the earlier infection, the juvenile-specific circulating antigen has been studied. This study characterizes the properties and immunodiagnostic potential of tegumental antigens (TA). The studies have done by identification the high immunogenic antigen by using natural and experimental F. gigantica-infected sera as primary antibodies. After that, the polyclonal antibodies (PoAbs) against the interested protein protein have produced. The specificity of PoAbs was carried out by ELISA and western immunoblotting. The characteristics of each antigen were identified by 1 and 2 dimensional gel electrophoresis, and periodic acid Schiff (PAS) staining. After the cross reaction experiment among the various parasites, the antigens were localized by immunoperoxidase technique. Sequencing of the most promising antigen has done by Tendem Mass spectrometry. Finally, the PaAb was used for immunodiagnosis by direct ELISA in the experimental infected rat’s sera. The result found that there are 4 bands of interested antigens; 16 kDa, 21 kDa, 25 kDa and 36 kDa. The PoAbs against these antigens have been produced and the PoAb anti 16 kDa showed highly cross reactivity with various antigens. Both PoAbs anti 25 kDa and 36 kDa express the cross reaction with 16 kDa band, whereas, PoAbs anti 21 kDa isveryspecific. All interested antigenic bands give positive result with PAS staining, shows that they contain carbohydrate moiety within the molecules. Moreover, PoAbs anti 21 kDa shows the cross reactive band with Paramphistomum sp. Antigen and PoAbs anti 25 kDa cross reacts with Eurytrema pancreaticum. The distributions of 25 kDa and 36 kDa are found in the parenchymal tissue, while 21 kDa is found mainly in the tegument of the juvenile and adult parasites. The distribution of 21 kDa shows that it is the most promising among the interested antigen. Thelatter study found that PoAb anti 21 kDa can reacts with 2 dots of antigens under 2 DE western immunoblotting and they arer characterized as calcium binding proteins. Finally, the result of ELISA diagnosis shows that PoAbs can be used for detection of the parasite infection as early as 3 weeks after infection. This study shows that TA is very important antigen and it can elicit the high specific host immune response. Especially, 21 kDa TA or calcium binding protein is the most interesting antigen that can be further investigated for the immunodiagnostic development of F. gigantic infection.	en