การพัฒนาวัคซีนจากโปรตีนสังเคราะห์สายสั้น (Short Synthetic Peptides) ในกลุ่มเอนไซม์ย่อยสลายโปรตีน และสารเสริมฤทธิ์ (Adjuvants) สำหรับโรคพยาธิใบไม้ตับ Fasciolosis

Abstract

พยาธิ Fasciola gigantica เป็นพยาธิใบไม้ในตับ ซึ่งเป็นพยาธิที่ก่อให้เกิดโรคพยาธิใบไม้ในตับ (Fasciolosis) ซึ่งเป็นโรคที่เกิดจากปรสิตเป็นปัญหาสำคัญต่อสุขภาพของคน และสัตว์เลี้ยง เช่น โค กระบือ แพะ และแกะ เป็นต้น การระบาดค่อนข้างมากในสัตว์เศรษฐกิจจำพวกโค กระบือ ในประเทศเขตร้อนรวมถึงประเทศไทย ซึ่งเมื่อเกิดการติดเชื้อก็สามารถทำให้เกิดตับอักเสบท่อน้ำดีอักเสบหรืออุดตัน ในปัจจุบันการรักษาด้วยยาฆ่าพยาธินั้นทำให้ในแต่ละปีจะต้องใช้ยาฆ่าพยาธิในปริมาณที่มากขึ้นเป็นผลให้เสียค่าใช้จ่ายค่อนข้างสูงทำให้ประเทศไทยสูญเสียรายได้ถึง 350-400ล้านบาทต่อปี จึงมีการใช้ Excretory secretory products (ES) เพื่อกระตุ้นภูมิคุ้มกันให้โฮสต์สร้าง IgG1, IgG2a เพื่อใช้ศึกษาการตอบสนองทางภูมิคุ้มกัน ซึ่ง ES เป็นโปรตีนแอนติเจนที่หลั่งออกมาจากทางเดินอาหารของพยาธิ ได้แก่ saposin-like protein2 (SAP-2), leucine aminopeptidase (LAP) ดังนั้นงานวิจัยในครั้งนี้จึงมีวัตถุประสงค์ recombinant Fasciola gigantica saposin-like protein 2 (rFgSAP-2) และrecombinant Fasciola gigantica leucine aminopeptidase (rFgLAP) และเปรียบเทียบความสัมพันธ์ระหว่างระดับแอนติบอดี กับจำนวนพยาธิใบไม้ตับ (worm recovery) ในการศึกษาครั้งนี้กระตุ้นภูมิคุ้มกันโดยใช้ combine vaccine เเบ่งหนูเป็น 6 กลุ่ม โดยหนูกลุ่มที่ 1 ไม่ได้รับวัคซีนและ Alum ซึ่งเป็น negative control กลุ่มที่ 2 เป็นหนูฉีด Alum เเละ Vaccine ซึ่งเป็น positive control กลุ่มที่ 3 ฉีดเฉพาะ Alum กลุ่มที่ 4 ฉีด Alum ร่วมกับ rFgSAP-2 กลุ่ม 5 ฉีด Alum เเละ ฉีด rFgLAP เเละ กลุ่ม 6 ฉีด Alum เเละ ฉีด rFgSAP-2 กับ rFgLAP โดยนำ rFgSAP-2 และ rFgLAP มาทำให้บริสุทธิ์ จากนั้นนำมาหาความเข้มด้วยวิธี (Lowry method) โดยสร้าง standard curve และวัดขนาดของโปรตีนด้วยการรันเจล (gel electrophoresis) เทียบกับ marker ซึ่งพบว่า SAP-2 มีขนาด 10 kDa เเละ LAP มีขนาด 57.6 kDa หลังจากนั้นกระตุ้นภูมิคุ้มกันของหนูด้วย rFgSAP-2 และ rFgLAP โดยใช้ระยะเวลา 0 สัปดาห์, 4 สัปดาห์ (infection) และ 6 สัปดาห์ (termination) จากนั้นนำซีรัมของหนูแต่ละช่วงเวลามาหาระดับ IgG1 และ IgG2a ที่ตอบสนอง โดยเทียบกับ positive control , negative control ,adjuvate control พบว่า ระดับเเอนติบอดี IgG1 มีค่ามากกว่า IgG2a ทั้งระยะ infection และ termination จากนั้นตรวจสอบความจำเพาะของ Anti-FgSAP-2, Anti-FgLAP และAnti-FgSAP-2 + Anti-FgLAP ต่อ recombinant protein SAP-2 (rFgSAP-2) เเละ recombinant protein LAP (rFgLAP) แต่ละชนิดด้วยวิธี Western blot พบว่า กลุ่มที่ 1 เป็นกลุ่ม SAP-2 โดยใช้ซีรัมของหนูที่ถูกกระตุ้นด้วย rFgSAP-2 กับ Alum, กลุ่มที่ 2 เป็นกลุ่ม LAP โดยใช้ซีรัมของหนูที่ถูกกระตุ้นด้วย rFgLAP กับ Alum เเละ กลุ่มที่ 3 เป็นกลุ่ม SAP-2+LAP โดยใช้ซีรัมของหนูที่ถูกกระตุ้นด้วย rFgSAP-2 เเละ rFgLAP กับ Alum ซึ่งจะ blot กับโปรตีน SAP-2 เเละ LAP พบว่า กลุ่มที่ 1 ให้ผลจำเพาะกับ rFgSAP-2, กลุ่มที่ 2 ให้ผลจำเพาะกับ rFgLAP และ กลุ่มที่ 3 ให้ผลจำเพาะกับ rFgLAP เเละ rFgSAP-2 จากนั้นดูตำแหน่งที่มีการแสดงออกของโปรตีนใน Fasciola gigantica ด้วยวิธี Immunohistochemistry โดยใช้ซีรัมของหนูที่ถูกกระตุ้นด้วย rFgSAP-2 กับ Alum, ซีรัมของหนูที่ถูกกระตุ้นด้วย rFgLAP กับ Alum ,ซีรัมของหนูที่ถูกกระตุ้นด้วย rFgLAP+rFgSAP-2 กับ Alum เเละใช้ 1X PBS เป็น negative control พบว่าระยะ infection มีการเเสดงของ LAP ที่บริเวณเยื่อบุลำไส้ (cecal epitheilial cell) , SAP-2 จะพบมีการเเสดงออกที่บริเวณเยื่อบุลำไส้ (cecal epitheilial cell) เเละ SAP-2+LAP จะพบมีการเเสดงออกที่บริเวณเยื่อบุลำไส้ (cecal epitheilial cell) เเละระยะ termination มีการเเสดงออกของ LAP ที่บริเวณอัณฑะ(testis) รังไข่(ovary) มีการเเสดงออกที่เเกรนูลที่บริเวณเยื่อบุลำไส้ (cecal epitheilial cell) , SAP-2 มีการเเสดงออกที่บริเวณอัณฑะ(testis) รังไข่(ovary) เเละเเกรนูลที่บริเวณเยื่บุลำไส้ (cecal epitheilial cell) เเละ SAP-2+LAP มีการเเสดงออกที่บริเวณอัณฑะ (testis) รังไข่ (ovary) เเละเเกรนูลที่บริเวณเยื่อบุลำไส้ (cecal epitheilial cell) โดยผลที่ได้นั้นสามารถนำไปพัฒนาศักยภาพของวัคซีนในการต้านการติดพยาธิใบไม้ Fasciola gigantica ได้