การตรวจการปนเปื้อนของเชื้อ Staphylococcus aureus และ Listeria monocytogrnes ด้วยเทคนิค multiplex PCR ในอาหารพร้อมรับประทาน

Abstract

Staphylococcus aureus และ Listeria monocytogenes เป็นแบคทีเรียก่อโรคที่สามารถพบได้ในอาหารทั่วไป โดยเฉพาะในอาหารพร้อมรับประทาน เนื่องจากอาหารที่พร้อมรับประทานจะไม่ผ่านกระบวนการให้ความร้อนมากนัก และส่วนใหญ่จะเก็บไว้โดยการแช่เย็น ซึ่งเป็นอุณหภูมิที่เชื้อ L. monocytogenes สามารถเจริญเติบโตได้ อีกทั้งอาหารประเภทนี้มักจะมีวิธีการเตรียมด้วยการใช้มือสัมผัส ดังนั้นอาจมีการปนเปื้อนของ S. aureus จากผิวหนังของผู้ประกอบอาหารได้ง่าย การวิจัยนี้ได้ออกแบบ primers ที่มีความจำเพาะต่อ Coagulase (coa) gene ของเชื้อ S.aureus และ PrfA gene ซึ่งเป็น virulence gene ของเชื้อ L.monocytogenes และนำมาใช้ใน multiplex PCR เพื่อใช้ในการตรวจหาการปนเปื้อนของแบคทีเรียทั้งสองชนิดดังกล่าวในอาหารพร้อมรับประทาน การทดสอบความไวของ multiplex PCR ในการทดลองนี้ พบว่า สามารถตรวจหา DNA ของเชื้อ S.aureus และ L. monocytogenes ได้อย่างต่ำสุด คือ 1 ng และ 0.15 ng ตามลำดับ และเมื่อทดสอบโดยจำลอง การปนเปื้อนของเชื้อทั้งสองในอาหาร พบว่า จำนวนเซลล์ของ S. aureus ที่น้อยที่สุดที่ multiplex PCR สามารถตรวจหาได้คือ 10 5 เซลล์ ต่ออาหาร 5 กรัม หรือประมาณ 10 4 เซลล์ ต่ออาหาร 1 กรัม และจำนวนเซลล์ของ L monocytogenes ที่น้อยที่สุดที่ multiplex PCR สามารถตรวจหาได้คือ 1 เซลล์ ต่ออาหาร 5 กรัม จากผลการทดลองยังพบว่า multiplex PCR นี้มีความจำเพาะมาก เนื่องจากไม่พบการเพิ่มจำนวน DNA ของเชื้ออื่น ๆ ที่ไม่จำเพาะกับ primers ที่ใช้ ผลการตรวจสอบการปนเปื้อนของ S. aureus และ L.monocytogenes ในอาหารพร้อมรับประทานที่ขายในแถบจังหวัดชลบุรี ด้วยวิธี miltiplex PCR พบว่าอาหารที่นำมาทดสอบจำนวนทั้งสิ้น 58 ตัวอย่าง ไม่มีการปนเปื้อนของแบคทีเรียทั้งสองชนิดนี้เลย อย่างไรก็ตามเพื่อเฝ้าระวังการเกิดการปนเปื้อนดังกล่าวอ่าจจะต้องมีการตรวจหาแบคทีเรียในอาหารเป็นระยะ ๆ ต่อไป จากการวิจัยครั้งนี้ วิธี multiplex PCR สามารถใช้เพื่อตรวจหาการปนเปื้อนของเชื้อ L. monocytogenes และ S. aureus ในอาหารพร้อมรับประทานได้ เนื่องจากเป็นวิธีที่รวดเร็ว มีความไวและความจำเพาะสูง นอกจากนี้ยังสามารถพัฒนาวิธีการหาเชื้อดังกล่าวเพื่อให้เป็นประโยชน์ต่อการเฝ้าระวังการปนเปื้อนหรือการระบาดของเชื้อต่อไป Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus are food-borne pathogene widerly distributed in dairy products, especially in ready-to-eat foods. Due to undercooked and storage of ready-to-eat foods in cold temperature is optimal for growth of L. monocytogenes. Moreover, S. aureus is commonly found on the skin of healthy people therefore it can contaminate in food products during preparation and processing. In this study, specific primers for Coagulase (coa) gene from S. aureus and PrfA gene from L. monocytogenes were designed and used for detection of those bacteria by a multiplex PCR. The multiplex PCR can detect at least 1 ngand 0.15 ng of S. aureus and L. monocytogenes DNA, respectively. Investigation of the artificially contaminated foods, the multiplex PCX was possible to detect S. aureus 10 5 celsl per 5 g (2 x 10 4 cells/g) of food and detect L. monocytogenes less than 1 cellper 5 g (< cell/g) of food. No amplification DNA of Related food pathogens in PCR reaction, indicate specificity of the primers. The multiplex PCX was then used as a tool to detect contaminated foods in local makets in Chonburi province. Fifty-eight samples of several types of ready-to-eat foods were analyzed and the results showed that none of them were contaminated with L. monocytogenes and S. aureus. However, it needs further Investigation for the surveillance in the future This multiples PCR can be used for L. monocytogenes and S. aureus detection incontaminated ready-to-eat foods as a rapid, high sensitive and specific assay. This multiplex PCR assay can be further developed, and could be benefit for public health and surveillance of disease outbreaks.